WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 | 3 |

«Москва 2012 г. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) ОТ СОСТАВИТЕЛЯ Цель пособия Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) – помочь овладеть навыком в постановке ПЦР. Рассмотрены стадии ...»

-- [ Страница 1 ] --

Основы полимеразной

цепной реакции

Основы полимеразной цепной реакции

(ПЦР)

методическое пособие

Москва

2012 г.

Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ОТ СОСТАВИТЕЛЯ

Цель пособия «Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР)» – помочь овладеть навыком в постановке ПЦР. Рассмотрены стадии проведения ПЦР, способы контроля прохождения реакции, типичные ошибки интерпретации результатов.

Представлены перспективы практического использования и современные тенденции развития ПЦР-диагностики.

Пособие предназначено для тех специалистов, которые готовятся к открытию клиникодиагностических лабораторий, а также может быть использовано сотрудниками уже действующих лабораторией.

Мы надеемся, что с помощью нашего пособия каждая диагностическая лаборатория сможет проводить ПЦР-диагностику на высоком уровне.

Содержание

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 1. Механизм полимеразной цепной реакции 1.1. Компоненты реакционной смеси 1.1.1. Основные компоненты 1.1.2. Дополнительные компоненты 1.2. Циклический температурный режим 1.3. «Эффект плато» 2. Стадии постановки ПЦР 2.1. Подготовка пробы биологического материала 2.2. Способ постановки ПЦР 2.3. Детекция результатов ПЦР 2.3.1. Метод горизонтального электрофореза 2.3.2. Метод вертикального электрофореза 2.3.3. Метод гибридизации после амплификации 2.3.4. Метод гибридизации в процессе амплификации 3. Контроль ПЦР 3.1. Производственный контроль 3.2. Внешний контроль работы лаборатории 3.3. Внутренний контроль качества 3.3.1. Внутренние контроли 3.3.2. Положительный контроль 3.3.3. Отрицательный контроль 3.3.4. Специальные контроли 4. Ошибки ПЦР 4.1. Ошибки преаналитического этапа 4.1.1. Место взятия биологического материала 4.1.2. Правильность взятия биологического материала 4.1.3. Обработка биологического материала 4.1.4. Хранение биологического материала Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) 4.2. Ошибки аналитического этапа 4.2.1. Выбор системы пробоподготовки 4.2.2. Генетическая изменчивость микроорганизмов 4.2.3. Технические ошибки 4.3. Ошибки постаналитического этапа 4.3.1. Ошибки интерпретации результатов 4.3.2. Сравнение результатов ПЦР и ИФА 4.3.3. Сравнение результатов ПЦР и микроскопии 4.3.4. Сравнение результатов ПЦР и культурального метода 4.4. Контаминация 5. Устройство ПЦР-лаборатории 6. Перспективы практического использования ПЦР-диагностики 6.1. Диагностика инфекций 6.1.1. Социально значимые инфекции 6.1.2. Особо опасные инфекции 6.1.3. Гемотрансмиссивные инфекции 6.1.4. Оппортунистические инфекции 6.1.5. TORCH-инфекции 6.2. Генетические исследования 6.3. Определение ГМО в пищевых продуктах 6.4. ПЦР в ветеринарии Список сокращений

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

артериальная гипертензия аланинаминотрансфераза аденозинтрифосфат вирус иммунодефицита целовека внутренний контроль ВОЗ Всемирная организация здравоохранения вирус папилломы человека ВЭБ вирус Эпштейн-Барр ГиФА гибридизационно-ферментный анализ ГМО генетически модифицированный ГОСТ Государственный стандарт ГЭ геном-эквивалент ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ дезоксинуклеотидтрифосфат дАТФ дезоксиаденозинтрифосфат дГТФ дезоксигуанозинтрифосфат дЦТФ дезоксицитозинтрифосфат дТТФ дезокситимидинтрифосфат ддАТФ дидезоксиаденозинтрифосфат ддГТФ дидезоксигуанозинтрифосфат ддЦТФ дидезоксицитозинтрифосфат ддТТФ дидезокситимидинтрифосфат дефицита ИППП инфекции, передаваемые половым ТОРС тяжёлый острый респираторный ИРТ инфекционный ринотрахеит УГ N-урацил-гликозилаза ИФА иммуноферментный анализ УДК универсальная десятичная Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) ФСВОК Федеральная система внешней (от англ. Immunoglobulin М) оценки качества ЦМВ цитомегаловирус эПЦР эмульсионная полимеразная цепная APS аденозин-5'-фосфосульфат FDA (от англ. Food and Drug Administration) Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами США FLASH (от англ. Fluorescent Amplificationполимеразная цепная реакция based Specific Hybridization) специфическая гибридизации в процессе амплификации с ДНКтяжелый острый респираторный зондами, меченными флуорофорами GWAS (от англ. Genome-wide association study) всегеномное исследования ассоциации GuSCN (от англ. Guanidine isothiocianatе) гуанидин изотиоцианат HBV (от англ. hepatitis В virus) вирус гепатита В HBeAg (от англ. HBe antigen) антиген «е» вируса гепатита В HCV (от англ. hepatitis C virus) вирус гепатита С HLA (от англ. Human Leucocyte Antigens) антигены гистосовместимости человека HPA (от англ. Human Platelet Antigen) R – краснуха (rubella), тромбоцитспецифические антигены С – цитомегаловирусная инфекция Введение

ВВЕДЕНИЕ

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе).

Открытию полимеразной цепной реакции предшествовало развитие молекулярно-биологических технологий.

В 1869г. И. Мишером была открыта ДНК. Биологическая функция нового вещества была не ясна.

В 1944г ученые О. Эвери, К. Мак-Леода и М.Мак-Карти провели ряд экспериментов по трансформации бактерий, доказавшие, что за трансформацию (приобретение болезнетворных свойств безвредной культурой в результате добавления в неё мёртвых болезнетворных бактерий) отвечают выделенные из пневмококков ДНК.

Вплоть до 50-х годов XX века точное строение ДНК и способ передачи наследственной информации оставались неизвестными, хотя и было доказано, что ДНК состоит из нескольких цепочек, состоящих из нуклеотидов.

Количественные соотношения между различными типами азотистых оснований в составе нуклеотидов ДНК были сформулированы в 1949–1951 гг. группой биохимика Э. Чаргаффа и получили название «правила Чаргаффа». Суть этих правил аключалась в следующем:

1. Количество аденина (А) равно количеству тимина (Т), а гуанина (Г) – цитозину (Ц): А=Т, Г=Ц.

2. Количество пуринов равно количеству пиримидинов: А+Г=Т+Ц.

Правила Чаргаффа, наряду с данными рентгеноструктурного анализа, сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК и определении принципа комплементарности Дж. Уотсоном и Ф. Криком в 1953 году. Ученые пришли к выводу, что ДНК состоит из двух полимерных цепей, удерживаемых водородными связями между азотистыми основаниями и образующих двойную спираль.

При этом азотистые основания формируют парные (комплементарные) комплексы аденин – тимин и гуанин – цитозин при взаимодействии цепей нуклеиновых кислот (рис.1). Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой цепи задается последовательностью комплементарных оснований цепи – матрицы.

Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) В 1955г. А. Корнберг открыл фермент, который назвал ДНК-полимеразой. Этот фермент способен удлинять короткие олигонуклеотидные затравки (праймеры), присоединяя к 3'-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид, но для этого необходимо, чтобы праймер был связан с комплементарной цепью ДНК (матрицей). Раствор, в котором происходит эта реакция, должен содержать нуклеозидтрифосфаты (дНТФ), используемые в качестве строительных блоков.

В 1971г. Клеппе и соавт. представили данные, касающиеся состава ингредиентов реакционной смеси, и принципы использования коротких искусственно синтезированных молекул ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК.

Однако возможность использования ПЦР в плане наработки большого количества копий нуклеиновых кислот еще не рассматривалась. Это было связано с техническими трудностями, обусловленными необходимостью трудоемкого синтеза праймеров, и нестабильностью фермента. В начале использования метода ПЦР после каждого цикла нагревания – охлаждения ДНК-полимеразу приходилось добавлять в реакционную смесь, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента.

В 1975г. Т. Брок и Х.Фриз открыли Thermus aquaticus – грамотрицательную палочковидную экстремально термофильную бактерию, а в 1976 г. из нее была впервые выделена Taq-полимераза.

Преимуществом данного фермента была способность стабильно работать при повышенных температурах (оптимум 72-80 °C).

В 1983-1984 гг. К. Мюллис провел ряд экспериментов по разработке ПЦР и первым начал использовать Taq-полимеразу вместо неустойчивой к высоким температурам ДНК-полимеразы. Это позволило ускорить работы по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллис вместе с Ф. Фалуном разработал алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР.

Таким образом, сформировался принцип использования ПЦР, как метода амплификации in vitro заданных фрагментов ДНК с полностью или частично известной последовательностью.

Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное практическое применение метода. В году Saiki с соавт. опубликовали статью, в которой была описана амплификация геномной последовательности -глобина. С этого момента количество публикаций, о применении ПЦР в своих работах, стало увеличиваться в геометрической прогрессии.

Особенно бурное развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии секвенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Это, в свою очередь, способствовало значительному росту информационных баз данных, содержащих последовательности ДНК различных биологических объектов.

В настоящее время предложены различные модификации ПЦР, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных мутаций, описаны десятки различных применений метода.

Таким образом, открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень.

Механизм полимеразной цепной реакции 1. Механизм полимеразной цепной реакции 1.1. Компоненты реакционной смеси 1.1.1. Основные компоненты Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси ряда основных компонентов.

Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы и должны отвечать ряду критериев:

z Быть специфичными. Особое внимание уделяют 3'-концам праймеров, так как именно с них Taqполимераза начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. Если их специфичность недостаточна, то высока вероятность, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить процессы неспецифического связывания, и синтеза фрагментов различной длинны, отличных от искомых. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.

z Не должны образовывать димеры и петли, то есть не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига (комплементарного присоединения) праймеров самих на себя или друг с другом.

z Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве критерия при выборе праймеров. При попадании на такую зону, отжиг праймеров не происходит, и, как следствие, возникает ложноотрицательный результат.

Taq-полимераза – термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание З'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) – «строительный материал», используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

Буфер – смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.

Анализируемый образец – подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) 1.1.2. Дополнительные компоненты Для удобства детекции или контроля эффективности амплификации в состав реакционной смеси могут быть включены дополнительные компоненты.

Внутренние контроли – гетерологичный специфическому фрагмент ДНК, как правило, большего размера, ограниченный (фланкированный) специфическими праймерами. Фактически, представляет собой альтернативную матрицу ПЦР и позволяет контролировать эффективность амплификации в каждой конкретной пробирке.

ДНК-зонды – искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера (около нуклеотидов), комплементарные специфическим ампликонам (продуктам реакции). Благодаря прикрепленным к ним изотопным или флуоресцентным меткам ДНК-зонды могут использоваться для детекции продуктов реакции.

1.2. Циклический температурный режим Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, которые обеспечиваются определенными температурными циклами.

Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов:

1. Денатурация – это переход ДНК из двухнитевой формы в однонитевую при разрыве водородных связей между комплементарными парами оснований под воздействием высоких температур (рис. 2).

2. Отжиг – это присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры подбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа.

Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит.

Механизм полимеразной цепной реакции 3. Элонгация (синтез). После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3'-конца праймера.

Температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, которая с максимальной эффективностью начинает синтез второй цепи ДНК от 3'-конца праймера, связанного с матрицей, и движется в направлении от 3' к 5' концу (рис. 3).

Иногда в случае близкого значения температуры отжига праймеров и температуры оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухэтапный ПЦР, совместив отжиг и элонгацию. Температурный цикл амплификации многократно повторяется (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается (рис. 4).

Результатом циклического процесса является экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК, которое можно описать формулой:

А = М*(2n- n-1)~2n, где А – количество специфических (ограниченных праймерами) продуктов реакции амплификации;

М – начальное количество ДНК-мишеней;

n – число циклов амплификации.

Реальное значение эффективности отдельных циклов амплификации составляет по некоторым данным 78-97%. Если в пробе присутствуют ингибиторы реакции это значение может быть намного меньше, поэтому фактическое количество специфических продуктов амплификации лучше описывает формула:

Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) А = М*(1+Е)n, где Е – значение эффективности реакции.

Следует заметить, что в процессе амплификации на исходной цепи синтезируются и длинные фрагменты, однако их накопление происходит лишь в арифметической прогрессии по формуле:

К = М*n, где К – количество длинных продуктов амплификации.

Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.

1.3.«Эффект плато»

Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает – «эффект плато».

Термин «эффект плато» используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3–1 пмолей.

В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения «эффекта плато» влияют:

z Утилизация субстратов (дНТФ и праймеров).

z Стабильность реагентов (дНТФ и фермента).

z Количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы.

z Неспецифические продукты и праймер-димеры, конкурирующие за праймеры, дНТФ и полимеразу.

z Концентрация специфического продукта за счет неполной денатурации при высокой концентрации ампликонов.

Стадия постановки ПЦР 2. Стадии постановки ПЦР ПЦР-анализ состоит из трех стадий.

2.1. Подготовка пробы биологического материала Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации.

Иногда достаточным бывает кипячение образца в течение 5–10 минут, однако в большинстве случаев требуются более трудоемкие методы.

Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, предложенная Marmur. Она включает в себя ферментативный протеолиз клеток с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Однако это метод довольно трудоемкий и предполагает работу с такими токсичными веществами, как фенол и хлороформ.

Популярным в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавт.

Он основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента – гуанидина изотиоционата (GuSCN) высокой молярности (5М) с последующей сорбцией ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко» и т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен и технологичен для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок, что имеет большое значение при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР, поэтому при использовании этого метода важны правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологии.

Следует отметить, что из-за большого количества стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, так кака возможна перекрестная контаминация между пробами образующейся аэрозолью ДНК.

Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а примеси, ингибирующие ПЦР. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца, в результате которого клеточные стенки разрушаются, а нуклеиновые кислоты выходят в раствор; и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом.

Тем не менее, встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, клеточные стенки некоторых микроорганизмов не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, допускается использование простых методов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией. В то же время, использование подобных методов пробоподОсновы полимеразной цепной реакции (ПЦР) готовки для клинической диагностики может приводить к ложноотрицательным результатам, вследствие использования в реакционной смеси некачественного препарата ДНК.

Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.

2.2. Способ постановки ПЦР На данный момент разработаны варианты постановки ПЦР, направленные на решение следующих задач: увеличение эффективности реакции и снижение риска образования неспецифических продуктов; реализацию возможности проведения как качественного, так и количественного анализа искомых участков молекулы ДНК/РНК.

Наиболее распространенными в клинико-диагностических лабораториях модификациями ПЦР являются:

ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR) – модификация, суть которой состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров.

Для этого полимеразная активность фермента в момент постановки ПЦР блокируется антителами или имитирующими антитела небольшими молекулами типа Affibody до наступления первой денатурации (проводится при 95 °C в течение 10 минут).

Кроме того, для предотвращения преждевременного взаимодействия фермента с компонентами реакционной смеси и, как следствие, образования неспецифических продуктов реакции до момента полного прогрева, используется легкоплавкий парафин или специальные масла, отделяющие полимеразу от реакционной смеси.

В зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют определенную температуру плавления Тm, при которой образование водородных связей нестабильно. Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, то есть температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двуцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и таким образом обеспечивает специфичность реакции.

Даже если неспецифический отжиг произошел до начала температурного циклирования, в отсутствии фермента элонгации не происходит, а при нагревании комплексы праймер-ДНК денатурируют, поэтому неспецифические продукты не образуются. В дальнейшем температура в пробирке не опускается ниже температуры плавления, что обеспечивает образование специфического продукта амплификации.

Таким образом, ПЦР с «горячим» стартом позволяет минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа.

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR) – используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности РНК. На первом этапе с помощью реверСтадия постановки ПЦР тазы (обратной транскриптазы), используя в качестве матрицы мРНК, проводят синтез одноцепочечной молекулы ДНК (кДНК), которая используется для последующей ПЦР. Для этого применяют обратную транскриптазу, выделенную из двух вирусов: Avian myeloblastosis virus и Moloney murine leukemia virus.

Использование ревертазы связано с некоторыми трудностями. Прежде всего, данный фермент термолабилен и поэтому может быть использован при температуре не выше 42°С. Так как при такой температуре молекулы РНК легко образуют вторичные структуры, то эффективность реакции заметно снижается и по разным оценкам приблизительно равна 5%. Этот недостаток может быть устранен при использовании в качестве обратной транскриптазы термостабильной полимеразы, проявляющей активность в присутствии ионов Мn2+. Это единственный известный фермент, способный проявлять как полимеразную, так и транскриптазную активность.

Для проведения реакции обратной транскрипции в реакционной смеси так же, как и в ПЦР, в качестве затравки должны присутствовать праймеры и смесь 4-х дНТФ.

Возможность использования РНК в качестве мишени для ПЦР существенно расширяет спектр применения этого метода, например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирусы гриппа, ВИЧ и т.д.) представлены именно РНК.

ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» (End-point PCR) – это модификация метода ПЦР, которая позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирки. Таким образом, решается одна из основных проблем ПЦР – проблема контаминации ампликонами.

Одним из таких вариантов является метод «FLASH» (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization – специфическая гибридизации в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флуорофорами).

Ключевым элементом метода «FLASH» является использование гибридизационных олигонуклеотидных зондов, меченных молекулами флуорофора и «темнового» гасителя. Зонды добавляют в реакционную смесь наряду с праймерами и остальными компонентами реакции. Поскольку в структуре зонда флуорофор и гаситель находятся в непосредственной близости друг от друга, то перед началом реакции флуоресценция отсутствует.

Во время реакции зонды гибридизуются с ДНК-мишенью, на стадии элонгации Taq-полимераза разрушает зонд благодаря 5'-экзонуклеазной активности и флуорофор оказывается свободным от гасителя. Таким образом, количество разрушенных зондов и, соответственно, уровень флуоресценции оказываются пропорциональными количеству образовавшихся ампликонов. Следует отметить, что регистрация флуоресценции происходит с помощью детектора флуоресценции после окончания реакции, поэтому метод не является количественным.

ПЦР в режиме «реального времени» (Real-Time PCR, ПЦР-РВ) – используется для одновременной амплификации и измерения количества искомой молекулы ДНК. Преимуществом данного подхода является возможность совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце в реальном времени после каждого цикла амплификации.

Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) Для этого используют флуоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК (интеркаляция возможна в случае, если краситель имеет подходящие размеры и химическую природу и может поместиться между основаниями ДНК) или модифицированные дезоксинуклеотиды, которые флуоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР для измерения малых количеств мРНК, что позволяет получать количественную информацию о содержании искомой мРНК в клетке и судить об уровне экспрессии гена в отдельной клетке или ткани.

Отличительными чертами ПЦР-РВ являются не только возможность количественного определения ДНК/РНК в исследуемом материале, но и отсутствие стадии электрофореза, что позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Также менее строгие требования предъявляются к организации ПЦР-лаборатории, становятся возможны автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.

Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР – это одновременная амплификация двух и более последовательностей ДНК в одной пробирке. Преимуществом данного метода является возможность выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов или генотипирования множественных аллелей и т.д., поместив пробу в одну пробирку.

Кроме того, возможны и другие варианты ПЦР, получившие наибольшее распространение в научно-исследовательских лабораториях, например:

Гнездовая («вложенная», англ. nested PCR) ПЦР – применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции.

Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

ПЦР «инвертированная» – используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для этого проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов.

Ассиметричная ПЦР – проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. Сама ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.

Метод молекулярных колоний – данная модификация основана на использовании акриламидного геля, который до начала ПЦР полимеризуют со всеми ее компонентами на поверхности. В процессе реакции в точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.

Стадия постановки ПЦР ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) – вариант ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Для реализации данного подхода используют смесь двух полимераз, одна из которых – Taq-полимераза с высокой процессивностью (способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая – ДНК-полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью (Pfu- полимераза). Она необходима для корректирования ошибок, внесённых Taq-полимеразой, при этом некомплементарные нуклеотиды удаляются с помощью Pfu-полимеразы.

Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) – ПЦР с использованием консервативных праймеров к последовательностям ДНК для родственных групп внутри одного или между разными видами. Например, подбор универсальных праймеров к рибосомальным 18S и 26S генам для амплификации видоспецифического межгенного спейсера: последовательность генов 18S и 26S консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов.

ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (RACE-PCR) Иммуно-ПЦР (immuno-PCR-IPCR) 2.3. Детекция результатов ПЦР На сегодняшний день существует несколько основных способов детекции результатов ПЦР:

z Электрофоретический (в агарозном или полиакриламидном геле) z Гибридизационно – ферментный z Гибридизационо – флуоресцентный:

– регистрация продукта после окончания реакции амплификации – «анализ по конечной точке»;

– детекция продукта в режиме «реального времени».

2.3.1. Метод горизонтального электрофореза Наиболее распространенным до недавнего времени являлся метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру (рис. 5). В этом случае визуализацию результатов проводят в пластине агарозного геля, который представляет собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5-2,5% с добавлением специального красителя ДНК, например бромистого этидия.

Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют лунки, в которые вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения.

Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияют:

концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК.

Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, который излучает свет в ультрафиолетовом диапазоне (254 – 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).

Яркость полос продуктов амплификации может быть различной, поэтому часто в ПЦРлабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако, как уже отмечалось ранее, это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце.

Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов.

2.3.2. Метод вертикального электрофореза Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом.

Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид и специальную камеру для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК с точностью до одного нуклеотида. Однако приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного, кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют.

Оба варианта электрофоретической детекции позволяют осуществлять только качественный анализ и сопряжены с рядом проблем:

z Большие затраты времени на стадию детекции z Невозможность автоматизации z Сложность и субъективность трактовки результатов z Высокий риск контаминации и большие затраты на ее устранение:

– повышенные требования к организации лаборатории;

– максимальное удаление зоны детекции от других зон проведения ПЦР;

– выделение отдельного сотрудника на стадию детекции;

– постоянный контроль смывов;

– большое количество К- для контроля контаминации ампликонами и, как следствие, увеличение объема расходных материалов и времени для подготовки к проведению детекции.

Стадия постановки ПЦР 2.3.3. Метод гибридизации после амплификации Другой способ детекции продуктов амплификации основан на гибридизации олигонуклеотидных зондов с продуктами амплификации. Зонды представляют собой искусственно синтезированные участки ДНК, содержащие ту или иную метку, детектируемую специальными приборами.

Для детекции продуктов ПЦР после окончания реакции амплификации необходимо специальное оборудование – детектор флуоресценции (например, приборы «Джин» или «Джин-4» производства НПФ «ДНК-Технология»).

В процессе своей работы прибор регистрирует флуоресцентное излучение, возникающее в реакционной смеси при освещении образца источником возбуждающего света. Регистрация производится последовательно для каждой из пробирок при её позиционировании относительно оптического блока с помощью шагового двигателя.

Флуорофоры для каждой из мишеней (например, для специфического искомого участка ДНК и внутреннего контроля) имеют свою длину волны, это позволяет регистрировать одновременно несколько сигналов по соответствующим каналам, что повышает производительность метода.

Такой подход позволяет свести к минимуму риск контаминации продуктами амплификации. Детекция результатов проводится в закрытых пробирках, что позволяет осуществлять ПЦР-исследования в одной комнате и обходиться меньшим количеством персонала. Кроме того, регистрация, интерпретация и хранение полученных результатов проводятся автоматически.

В результате указанный способ детекции существенно сокращает время проведения анализа и исключает возможность субъективной оценки полученных результатов, что повышает качество работы лаборатории. Тем не менее необходимо помнить, что реализация данного подхода позволяет проводить только качественный анализ.

Различные варианты детекции по конечной точке позволяют оценить количество исходной ДНК методом серийных разведений, определяя количество работающих разведений и сравнивая их с контрольными образцами с известной концентрацией ДНК. Однако данный подход является слишком трудоемким и практически не применяется в условиях диагностических лабораторий.

2.3.4. Метод гибридизации в процессе амплификации Данный метод, как упоминалось ранее, позволяет учитывать результаты реакции, не открывая пробирки. Регистрация результатов по уровню флуоресценции происходит с помощью специального оборудования.

Ключевым элементом метода является использование гибридизационных олигонуклеотидных зондов, меченных молекулами флуорофора и «темнового» гасителя.

Наиболее часто применяется флуоресцентный краситель 6-FAM (6-карбоксифлуоресцеин), с длинной волны возбуждения 488 нм, который легко связывается с олигонуклеотидами и обеспечивает высокую интенсивность сигнала. Поэтому под анализ с его использованием адаптированы многие приборы.

Также активно применяют SYBR Green I, который при связывании с двухцепочечной ДНК вызывает увеличение флуоресценции. В качестве референсного красителя широко используется ROX.

Для выявления продуктов амплификации применяют следующие наиболее распространенные подходы:

Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) Выщепление 5' концевой метки – метод основан на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входят флуоресцентная метка в 5'-положении, гаситель флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу.

В ходе ПЦР во время стадии отФлуорофор Гаситель жига праймеров происходит присоеЗонд продуктов амплификации образуетСвязывание зонда с матрицей (ДНК) ся в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующиИзлучение флуорофора ми ампликонами. Во время стадии достижении зонда начинает его расПолимераза с 5 - эндонуклеазной активностью щеплять благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности (рис. 6).

Таким образом происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение.

Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями – методика отличается от описанной выше тем, что концевые последовательности зонда представляют собой взаимно комплементарные области, а флуорофор и гаситель присоединяют к концевым нуклеотидам. При температуре отжига свободные зонды образуют шпильки за счет наличия комплементарных участков. При этом флуорофор и гаситель оказываются в непосредственной близости, что приводит к тушению флуоресценции.

При отжиге праймеров зонды комплементарно присоединяются к амплифицируемому участку ДНК, гаситель оказывается пространственно отделен от флуорофора и наблюдается рост флуоресцентного сигнала. Такие зонды часто называют «молекулярными беконами»

(molecular beacons) (рис. 7).

Стадия постановки ПЦР Таким образом, количество присоединившихся зондов и, соответственно, уровень флуоресценции оказываются пропорциональными количеству образовавшихся специфических продуктов ПЦР.

Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии – данный способ детекции отличается повышенной специфичностью, так как увеличение флуоресценции происходит при комплементарном связывании с ампликонами сразу 2-х фору, который находится на 5` конСвязывание зонда с матрицей (ДНК) це второго зонда, причем расстояние между флуорофорами составляет 1- флуорофором передается на второй флуорофор, а его излучение детектируется прибором (рис. 8).

Использование интеркалирующих красителей – этот способ детекции основан на том, что флуоресценция интеркалирующих красителей значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации.

Для анализа в режиме «реального времени» используют специальные ДНК-амплификаторы с оптическим блоком, позволяющие детектировать флуоресценцию внутри реакционной пробирки в ходе реакции. При амплификации образца детектируемый флуоресцентный сигнал может состоять из трех последовательных участков:

1 – базовая линия (сигнал не превышает предела детектирования прибора);

2 – экспоненциальная амплификация;

3 – плато.

Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает пропорционально количеству продукта амплификации. Мониторинг сигнала позволяет построить кинетическую кривую реакции, при этом, момент заметного увеличения сигнала и отрыва его от фонового – так называемый пороговый цикл – зависит от исходного количества ДНК-мишени. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл.

Главным преимуществом детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени» является возможность проведения количественного анализа.

При количественном исследовании образцов каждая серия экспериментов сопровождается постановкой амплификации с контрольными образцами, в которых заведомо известно количество коОсновы полимеразной цепной реакции (ПЦР) пий ДНК (калибровочные образцы). Сравнение кинетики накопления продуктов амплификации в экспериментальных и контрольных образцах позволяет оценить концентрацию ДНК в диапазоне разведений контрольных препаратов ДНК.

Следует отметить, что для выполнения количественного ПЦР-анализа рекомендуется использование препаратов ДНК с высокой степенью очистки, так как присутствие нежелательных примесей (ингибиторов) снижает эффективность амплификации исследуемой и контрольной ДНК.

Для контроля точности количественного анализа используют калиброванные внутренние контроли. В некоторых случаях возможны потери ДНК на стадии выделения, приводящие к существенному искажению значения реального количества ДНК в образце. Для контроля за такими потерями в образец перед пробоподготовкой вносят внутренний контроль, количество которого определяют вместе с количеством ДНК инфекционного агента.

Кроме того, появляется возможность реализовать анализ кривых плавления, когда после окончания ПЦР реакционную смесь нагревают и непрерывно измеряют флуоресценцию. По достижении температуры плавления продукта амплификации флуоресценция резко снижается.

Каждое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответствует числу полосок, получаемых на электрофорезе, то есть числу разных типов ампликонов. Применение кривых плавления не ограничивается только детекцией продуктов амплификации с помощью интеркалирующих флуорофоров.

При использовании кривых плавления в системах с ДНК-зондами возможно различать точечные мутации, расположенные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда.

Наличие таких мутаций способно привести к изменению температуры плавления зонда и изменениям в графике кривой плавления. Использование кривых плавления не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных манипуляций с пробирками, а интерпретация полученных данных автоматизирована и формализована.

К приборам, позволяющем получать количественные результаты ПЦР анализа, следует отнести модели ДТ-96 (ДТпрайм) и ДТ 48 (ДТлайт) (НПФ «ДНК-Технология», Россия) «iQ5» и CFX (BioRad, США), «COBAS Amplicor» (Roche, США), «АВI PRISM 7400» (ABI, США), «RotorGene» (Qiagen, GmbH Германия), Smart Cycler (Cepheid, США) и другие. Эти приборы позволяют следить за кинетикой накопления продуктов амплификации.

Таким образом, данный подход имеет ряд преимуществ по сравнению с методами анализа по конечной точке:

z количественный анализ специфической ДНК в широком диапазоне концентраций;

z сравнительный количественный анализ нескольких типов ДНК в одной пробирке;

z обнаружение и определение процентного содержания ДНК с измененной последовательностью;

z автоматизация и стандартизация ПЦР-анализа.

Контроль ПЦР 3. Контроль ПЦР Лаборатории, использующие в своей работе метод ПЦР, должны осуществлять следующие виды контроля:

z Производственный z Внутрилабораторный z Внешний контроль работы лаборатории 3.1. Производственный контроль Производственный контроль регламентирован СП 1.1.1058-01 «Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарнопротивоэпидемических (профилактических) мероприятий» с изменениями и дополнениями (СП 1.1.2193-07). Программа (план) производственного контроля должна включать перечень официально изданных санитарных правил, методов и методик контроля факторов в соответствии с осуществляемой деятельностью. Обязательным является выполнение требований санитарных правил и проведение санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий, подтвержденных проведением самопроверки (производственным контролем). В этом случае необходимости в постоянных проверках со стороны надзорных органов не возникает.

3.2. Внешний контроль работы лаборатории Согласно Методическими указаниями (МУ1.3.2569-09) «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», лаборатория должна осуществлять следующие виды контроля:

z Лаборатория должна принимать участие, в установленном порядке, в мероприятиях (программах) по внешней оценке качества лабораторных исследований (ФСВОК и т.д.) по конкретным нозологическим формам не реже 1 раза в год.

z Внутрилабораторный и внешний контроль качества лабораторных исследований осуществляют путем анализа шифрованных аттестованных контрольных панелей, содержащих «положительные» и «отрицательные» пробы Федеральная система внешней оценки качества клинических лабораторных исследований (ФСВОК) – один из важнейших элементов системы обеспечения качества клинической лабораторной диагностики, функционирует с 1995 года.

Деятельность ФСВОК осуществляется под общим руководством Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (Росздравнадзор), во взаимодействии с ее территориальными органами и органами управления здравоохранением и в соответствии с приказом МЗ РФ № 9 от 26.01.94, № 117 от 03.05.95, № 60 от 19.02.96, № 380 от 25.12.97, № 45 от 07.02. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и письмами Росздравнадзора руководителям территориальных Управлений и руководителям медицинских организаций № 01И-787/05 от 26.12.05 и 01И-748/07 от 20.11.07.

В настоящее время система состоит из 141 раздела (89 собственных разделов ФСВОК и 52 раздела, совместных с зарубежными системами внешней оценки качества), охватывающих все основные виды клинико-лабораторных исследований. Ежегодно в ФСВОК участвует около семи тысяч клинико-диагностических лабораторий Российской Федерации.

Основными разделами ФСВОК относительно ПЦР являются:

ПЦР – выявление микобактерий туберкулеза Молекулярно-генетическое выявление лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза ПЦР – выявление вируса гепатита В (HBV) ПЦР – выявление HCV ПЦР – выявление ВИЧ ПЦР – выявление C. trachomatis, M. hominis, U.urealiticum ПЦР – выявление N.gonorrhoeae ПЦР – выявление вируса папилломы человека (ВПЧ) Количественное определение ДНК вируса гепатита В (ВГВ) методом ПЦР Количественное определение РНК вируса гепатита с (HCV) методом ПЦР 3.3. Внутренний контроль качества Порядок проведения внутрилабораторного контроля качества определяется в МУ1.3.2569-09 следующими мероприятиями:

z В лаборатории, использующей методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) в диагностических целях, проводят внутрилабораторный контроль качества проводимых исследований с периодичностью, зависящей от объема выполняемой работы и определяемой руководителем лаборатории, но не реже одного раза в квартал.

z При проведении внутрилабораторного контроля качества лабораторных исследований могут использоваться аттестованные на наличие аналита (его количества) панели производителей коммерческих наборов или внутрилабораторные аттестованные образцы, содержащие и не содержащие нуклеиновые кислоты конкретных возбудителей в различной концентрации, стабильные в условиях хранения.

Реализация указанных положений возможна при использовании следующих подходов:

1. Постановка внутренних контролей (ВК) 2. Использование отрицательных контрольных образцов (К-) 3. Использование положительных контрольных образцов (К+) 4. Постановка специальных контролей 5. Регулярные смывы с поверхностей Контроль ПЦР 3.3.1 Внутренние контроли Препарат ДНК, подготовленный к ПЦР из биологического материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях и приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя. Поэтому становится необходимым контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью.

Для этой цели в каждую пробирку добавляют дополнительный, так называемый, внутренний контроль. Он представляет собой любой препарат ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Для инфекционных тест-систем иногда используют, например, -глобиновый ген, к концам которого с помощью генно-инженерных манипуляций «пришивают» участки ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы.

При отсутствии регистрации внутреннего контроля и выявления специфической ДНК результат следует считать недостоверным. В этом случае для данного исследуемого образца рекомендуется перевыделить ДНК.

Если внутренний контроль внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он отличался от специфических ампликонов в 2 и более раз.

В результате, если внести ДНК внутреннего контроля в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, внутренний контроль станет причиной образования ампликонов, которые отличаются по размеру от специфических ампликонов, получаемых после постановки ПЦР в присутствии специфической ДНК микроорганизма.

Наличие ампликонов внутреннего контроля в реакционной смеси будет свидетельством нормального прохождения реакции амплификации и отсутствия ингибиторов. Если ампликоны нужного размера не образовались, но не образовались также и ампликоны внутреннего контроля, можно сделать вывод о возникшей проблеме при прохождении ПЦР как следствие наличия в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, либо технологических нарушений. В любом случае результат реакции следует признать недостоверным.

Важно отметить, что если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации может заметно снижаться из-за конкуренции за праймеры с ДНК ВК. Это особенно заметно при низких концентрациях ДНК в испытуемом образце и может приводить к ложноотрицательным результатам. Поэтому концентрация внутреннего контроля должна быть такой, чтобы не составлять конкуренции для амплификации даже единичных искомых молекул ДНК.

Количественный анализ ВК позволяет в каждой пробе оценивать потери выявляемой ДНК/ РНК на стадии пробоподготовки, а также определить снижение эффективности за счет ингибиторов обратной транскрипции или ПЦР. В связи с этим ВК должен удовлетворять следующим требованиям:

z Амплификация ДНК ВК должна происходить и регистрироваться независимо от присутствия и количества искомой ДНК в реакционной смеси для всего диапазона определяемых концентраций, т.е. ВК не должен быть конкурентным.

Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) z Эффективность амплификации ВК и исследуемых проб должна быть одинаковой, а ее количество должно соответствовать линейному участку диапазона определяемых концентраций ДНК-мишени.

z В случае диагностики инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами, в состав ВК должен входить целевой фрагмент специфической РНК, из которой перед проведением ПЦР будет синтезирована кДНК посредством обратной транскрипции. Применение ВК на основе ДНК-конструкций при количественном анализе РНК не позволяет учитывать ее потери за счет повышенной физической и ферментативной деградации, а также контролировать процесс обратной транскрипции.

3.3.2. Положительный контроль Положительный контроль позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции. Для этого используют препарат ДНК, содержащий сайты для отжига праймеров, например, ДНК искомого микроорганизма или клонированные специфические участки его генома. Неспецифические ампликоны отличаются по размеру от ампликонов, образующихся в результате амплификации с контрольным препаратом ДНК. Они могут быть как большего, так и меньшего размеров по сравнению с положительным контролем. В худшем случае их размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные.

Для контроля специфичности образуемого продукта амплификации можно использовать гибридизационные зонды, меченные флуоресцентными метками или радиоактивными изотопами и взаимодействующие с ДНК в соответствии с теми же принципами, что и праймеры.

3.3.3. Отрицательный контроль Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя вследствие контаминации и исключения учета ложноположительных результатов.

3.3.4. Специальные контроли Использование специальных контролей при постановке ПЦР позволяет решить ряд задач, в первую очередь, касающихся оценки эффективности процесса амплификации и контроля специфичности полученных результатов, а также дает возможность реализовать подход к количественному анализу ДНК.

Принципиальным моментом является постановка специальных контролей при исследовании сложных многокомпонентных систем, таких как биоценозы, поскольку появляется возможность качественного и количественного анализа взаимодействия компонентов системы и характеристики их отношения к биотопу.

К специальным контролям можно отнести следующее:

z Маркеры длин фрагментов ДНК z Контроль фона z Стандарты и калибраторы z Контроль взятия материала (КВМ) Контроль ПЦР Маркеры длин фрагментов ДНК используются при детекции результатов ПЦР методом гельэлектрофореза. Стандарты (маркеры) представляют собой фрагменты двуцепочечной ДНК строго определенной длины, позволяющие идентифицировать и охарактеризовать полосы, полученные в геле, и оценить результаты анализа с точки зрения их специфичности.

Контроль фона наиболее актуален при использовании метода гибридизации в процессе амплификации. Это обусловлено тем, что помимо флуоресценции, возрастающей пропорционально синтезу ампликонов (ПЦР-РВ) или определяющейся после амплификации (FLASH), прибор регистрирует фоновую флуоресценцию, величина которой зависит от: свойств меченых зондов; изменения концентрации отдельных компонентов реакционной смеси в зависимости от серии, режима и продолжительности хранения; используемого пластика; особенностей регистрирующей аппаратуры.

Анализ величины целевого сигнала от ампликонов над фоновой флуоресценцией и шумами в процессе ПЦР-РВ позволяет установить некоторое пороговое значение флуоресценции. Оно одинаково для всех совместно анализируемых проб, и осуществляется автоматически, не требуя дополнительных манипуляций по приготовлению фоновых образцов. При проведении же анализа методом FLASH существует необходимость введения отдельных фоновых пробирок.

Стандарты и калибраторы наиболее часто используются при осуществлении количественного анализа методом ПЦР. Введение этого типа контролей предполагает построение калибровочного графика в координатах с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата в экспериментальных образцах.

Точность метода зависит от того, насколько условия ПЦР серии стандартов (прежде всего, эффективность амплификации) близки к условиям ПЦР экспериментальных образцов.

В тех случаях, когда требуется оценить «абсолютное» количество субстрата, выбор стандартов для градуировочного графика представляет собой сложную задачу.

Для определения количества матрицы в ПЦР-РВ существуют следующие варианты стандартов:

Очищенный продукт ПЦР-РВ.

Рекомбинантная ДНК.

Рекомбинантная РНК с последующей обратной транскрипцией.

Синтетический олигонуклеотид, содержащий амплифицируемую последовательность.

Если достаточно определить лишь относительную концентрацию субстрата, для построения калибровочного графика удобно использовать серию разведений одного из экспериментальных образцов. В тех случаях, когда образцы могут сильно отличаться по примесям и доле амплифицируемого фрагмента в реакционной смеси, необходимо приготовить серию разведений каждого из них и сравнить эффективности.

Однако приготовление серии стандартов непосредственно из экспериментального образца может привести к низкой достоверности данных. Во-первых, концентрация субстрата в образце может быть недостаточно высокой для того, чтобы при разведении в 8–10 раз давать достоверные результаты. В этом случае можно попробовать сконцентрировать образец. Во-вторых, содержание примеОсновы полимеразной цепной реакции (ПЦР) сей в препарате может негативно отражаться на эффективности реакции, в то время как разведение препарата будет уменьшать концентрацию примесей и, соответственно, увеличивать эффективность.

Использование стандартов и калибраторов позволяет определить концентрацию ДНК в двух вариантах (например, при анализе на наличие патогенных микроорганизмов в пробе):

z количество геномных эквивалентов клеток микроорганизмов в единице объема клинического образца (ГЭ/мл), что отражает абсолютную концентрацию данных микроорганизмов в клиническом материале;

z расчет соотношения количества геномов на количество геномов клеток человека. Для этой цели в ПЦР-смеси наряду с калибраторами ДНК микроорганизма присутствуют калибраторы человеческой ДНК. Полученные таким образом относительные значения концентрации ДНК микроорганизма к ДНК человека могут отражать плотность обсемененности искомыми микроорганизмами.

Контроль взятия материала – ключевой момент в определении качества взятой для исследования пробы. Данный подход позволяет исключить ошибки преаналитического этапа при исследовании биологического материала, содержащего клетки человека, и избежать получения недостоверных, ложноположительных или ложноотрицательных результатов ПЦР. Кроме того, он может быть использован для оценки количества геномной ДНК человека.

Таким образом, существует спектр подходов, обеспечивающий получение достоверных результатов, которые позволяют контролировать качество и эффективность прохождения ПЦР и оптимизировать работу лаборатории.

Тем не менее, в процессе реализации данного молекулярно-генетического метода исследования возникает ряд типовых ошибок.

Ошибки ПЦР 4. Ошибки ПЦР Выделяют три основных этапа при подготовке и проведении анализа методом ПЦР, в которых наиболее часто допускают ошибки, приводящие к получению ложноположительных и ложноотрицательных результатов:

z Преаналитический этап z Аналитический этап z Постаналитический этап 4.1. Ошибки преаналитического этапа Данный этап включает взятие биоматериала, его хранение и транспортировку, пробоподготовку (СП 1.2.036-95, СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08).

4.1.1. Место взятия биологического материала В первую очередь, необходимо правильно определить место взятия биологического материала для исследования, а именно: место предполагаемой локализации инфекционного процесса.

В первую очередь, это касается тех микроорганизмов, для которых известна тропность ко многим видам тканей, например, M.tuberculosis (обусловливает развитие внелегочных форм туберкулеза, в том числе: органов пищеварительной и мочеполовой систем; центральной нервной системы и мозговых оболочек; костей и суставов; кожи; глаз); C.trachomatis (вызывает воспалительные заболевания экстрагенитальной локализации – воспалительные заболевания органов малого таза и брюшины, и восходящий инфекционный процесс – поражения слизистой оболочки матки, труб, яичников, околоматочных связок). Исходя из этого, выбор универсального материала, например, мокроты для выявления кислотоустойчивых микобактерий, либо соскоба из влагалища, цервикального или мочеиспускательного каналов для выявления C.trachomatis может привести к ложноотрицательным результатам в ПЦР.

Кроме того, распространенным, но при этом ошибочным является подход к выявлению спектра патогенных микроорганизмов, особенно возбудителей инфекций, передающихся половым путем (ИППП), в крови пациента. Необходимо учитывать, что для большинства возбудителей ИППП гематогенный путь распространения не является основным, либо не доказан, соответственно, кровь, как материал для исследования, не является пригодной.

Кроме того, даже в случае присутствия в крови отдельных клеток микроорганизмов – возбудителей ИППП, вероятность их обнаружения крайне мала, поскольку оказывается ниже предела чувствительности стандартных тест-систем.

4.1.2. Правильность взятия биологического материала Второй распространенной ошибкой преаналитического этапа является неправильное взятие материала на исследование. Даже при правильном определении места взятия материала необходимо учитывать тот факт, что он должен содержать максимальную концентрацию искомых микроорганизмов, а также быть лишен нежелательных примесей, ингибирующих ПЦР.

Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) Так при исследовании на наличие внутриклеточных патогенов, проба должна содержать максимальное количество клеток, например, эпителиальных для выявления C.trachomatis, ВПЧ. Для выявления вируса Эпштейн-Барр (ВЭБ) и цитомегаловируса (ЦМВ) целесообразно использовать лейкоцитарную массу крови. Принципиальным является также стадия заболевания, а именно: осуществляется ли взятие материала в период ремиссии или обострения, что напрямую влияет на концентрацию искомых микроорганизмов в пробе.

Кроме того, необходимо минимизировать количество примесей в пробе, например, слизи, гноя и крови в эпителиальном соскобе, для чего их избыток необходимо удалить стерильным ватным тампоном непосредственно перед взятием образца.

Таким образом, следующей распространенной ошибкой может стать неправильная обработка материала.

4.1.3. Обработка биологического материала При работе с кровью важно учитывать тот факт, что для предотвращения ее свертывания в процессе доставки необходимо использовать антикоагулянты. Однако, наиболее распространенный антикоагулянт – гепарин является мощным ингибитором ПЦР, поэтому его использование в данном случае недопустимо.

Относительно гепарина следует заметить, что его присутствие в крови у пациентов, находящихся на антикоагулянтной терапии, также может привести к получению недостоверных результатов в ПЦР, поэтому забор крови у таких пациентов рекомендовано проводить до очередного введения препарата.

При необходимости использовать в качестве материала для исследования мочу (клеточный осадок первой порции утренней мочи) важно тщательно промыть пробу физиологическим раствором.

Это обусловлено тем, что осадок содержит большое количество солей и мочевины, которые, при использовании технологий флуоресцентной детекции, денатурируют зонды, приводя к ложноположительным результатам.

4.1.4. Хранение биологического материала Принципиальным для получения адекватных результатов ПЦР является хранение биологического материала.

Необходимо помнить о температуре хранения биологического материала, а также сроках и способах его доставки в ПЦР-лабораторию в случае, если транспортировка требует значительного времени. При нарушении сроков хранения или транспортировки биоматериала ДНК или РНК возбудителя могут разрушаться, что приведет к ложноотрицательным результатам. Образцы рекомендуется хранить при температуре от 2 до 8°С в течение 24-48 часов, для более длительного хранения необходимо замораживание. Единственное исключение – цельная кровь, которая не подлежит замораживанию.

При проведении исследований на наличие вирусов гепатитов В и С, ВИЧ и т.д. необходимо получение плазмы крови, и в этом случае возможно однократное замораживание пробы.

В настоящее время, процессы взятия материала, его предварительной обработки, хранения и перевозки, передачи исследуемого материала в другие организации осуществляются согласно инструктивно-методическим документам, регламентирующим выполнение исследований для каждого вида возбудителя инфекций, инструкциям к наборам реагентов и в соответствии с СП 1.2.036-95, СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08.

Ошибки ПЦР 4.2. Ошибки аналитического этапа 4.2.1. Выбор системы пробоподготовки Проведение собственно лабораторного исследования также может сопровождаться рядом ошибок, среди которых одной из основных является неправильный выбор системы пробоподготовки.

Возвращаясь к сказанному выше, наиболее часто в лаборатории используют следующие варианты пробоподготовки:

z Экспресс-методы – упрощенные методики, основанные на кипячении, протеолизе z Сорбентные методы z Методы одновременного выделения ДНК/РНК, выделение из цельной крови Выбор метода выделения должен определяться характером биоматериала, степенью его загрязнения потенциальными ингибиторами ПЦР.

Использование экспресс-методов существенно сокращает время пробоподготовки, делает минимальными потери ДНК в процессе выделения и существенно сокращает риск кроссконтаминации, что представляется весьма привлекательным для рутинного использования в лаборатории.

Однако, существенным недостатком данной группы методов является низкая степень очистки пробы от ингибиторов, следствием чего 3-5% образцов дают недостоверные результаты в ПЦР.

При необходимости использования экспресс-методов со «сложными» образцами возможно введение дополнительных способов очистки и концентрации материала, например, в случае избытка слизи в пробе (для мокроты и эякулята, бронхоальвеолярного лаважа, промывных вод бронхов, трахеального смыва, синовиальной и плевральной жидкости) целесообразным является ее предварительная обработка муколитиками, типа муколизина.

Тем не менее, даже предварительная обработка материала не подходит для бактерий с крепкой клеточной стенкой и может привести к ложноотрицательным результатам в ПЦР.

В случае исследования крови на наличие вирусов, особенно относящихся к группе РНКсодержащих (ВИЧ, гепатит С и т.д.), вероятность получения ложноотрицательных результатов велика по следующим причинам: исходно низкая вирусная нагрузка и течение болезни в периоде ремиссии (концентрация вирусных частиц ниже предела чувствительности тест-системы); неравномерное распределение материала по пробиркам в дублях; нестабильность исходно выделяемой РНК; большие потери материала на этапе пробоподготовки. Повышение эффективности выделения и получение адекватных результатов ПЦР возможно при использовании гемолитика для предварительной обработки цельной крови и увеличения выхода осадка лейкоцитов.

В данном случае экспресс-методы проявляют крайне низкую эффективность, и наиболее правильным представляется использование сорбентных методов выделения или методов, позволяющих одновременно выделять ДНК/РНК. Данные методы можно определить как «универсальные».

Однако для них характерно:

– длительное время выделения; – опасность кросс-контаминации;

Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) 4.2.2. Генетическая изменчивость микроорганизмов Вероятность получения ложноотрицательного результата может быть обусловлена изменчивостью микроорганизмов. При конструировании тест-системы в качестве мишени используется высоко консервативный участок генома. Однако изменчивость микроорганизмов может приводить к тому, что некоторые генотипы или штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать мутации в амплифицируемом участке ДНК и становиться недоступными для анализа данной тест-системой.

Например, у 30% пациентов с установленным диагнозом «хламидиоз», обусловленным С.trachomatis, при проведении исследований методом ПЦР результат анализа был отрицательным при полном соблюдении технологии. Это обусловлено тем, что часть коммерческих тест-систем в качестве мишени использовали плазмиду патогена, тогда как патологический процесс был связан с бесплазмидными штаммами бактерий.

4.2.3. Технологические ошибки Основной ошибкой аналитического этапа при реализации метода ПЦР с детекцией результатов с помощью гель-электрофореза является риск принять неспецифичные фрагменты за специфичные, если они близки по длине и нет возможности сравнить с К+ и маркером длин фрагментов.

Проблемой, наиболее актуальной для лабораторий, работающих с ПЦР в формате FLASH, является неправильное приготовление фоновых пробирок. В первую очередь, это связано с тем, что в разных сериях реактивов могут отличаться концентрации компонентов реакционной смеси, поэтому высока вероятность различного уровня флуоресценции. Приготовление фоновых пробирок без учета серии тест-системы может привести к большому количеству недостоверных результатов.

Кроме того, при приготовлении фонов необходимо исключить добавление в них полимеразы, так как, если в тест-систему входит внутренний контроль и/или отрицательный образец проходит стадию выделения, все отрицательные значения будут недостоверными.

Еще одним фактором возникновения ложноположительных и ложноотрицательных результатов в ПЦР с детекцией по конечной точке может быть неправильное хранение фоновых пробирок.

Это объясняется тем, что при неправильном хранении зонды в фоновых пробирках могут разрушаться, и нормировочные значения существенно увеличиваются за срок от нескольких часов до нескольких дней, при этом значения флуоресценции в образцах оказываются в большей или меньшей степени занижены.

Главным критерием достоверности полученных результатов в данном случае могут служить отрицательные пробы. При отсутствии расхождений между фоновыми и амплификационными пробирками отрицательные образцы имеют значения флуоресценции близкие к 1 или, в редких случаях, незначительно выше.

Если значения флуоресценции в одном или нескольких образцах или отрицательном контроле существенно ниже 1, с большой долей вероятности можно утверждать, что фоновые пробирки не соответствуют данному исследованию, в этом случае необходимо их поменять.

В случае неправильного хранения амплификационных пробирок (длительное пребывание пробирок при комнатной температуре) фоновая флуоресценция в них возрастает, в то время как в фоновых пробирках флуоресценция остается неизменной. В этом случае увеличивается Ошибки ПЦР содержание положительных результатов с низкими значениями флуоресценции. Результаты при этом получаются такие же, как при контаминации в лаборатории, однако в данном случае все низкие значения флуоресценции будут примерно одинаковы, что в случае контаминации встречается достаточно редко, поскольку маловероятно, что во все отрицательные пробирки попадет равное количество постороннего материала.

Несмотря на очевидные преимущества метода ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени, возможны ошибки аналитического этапа, обусловленные следующим: колебанием флуоресценции в приборе, которое может быть зафиксировано программой, как ложноположительный или ложноотрицательный результат. В этом случае необходимо провести анализ индивидуальной кривой. Пороговая линия должна пересекать индивидуальную кривую в области начала экспоненциального роста флуоресценции.

4.3. Ошибки постаналитического этапа Основной проблемой постаналитического этапа является неверная интерпретация врачом результатов ПЦР-анализа вследствие ошибочных представлений об инфекционном агенте или о возможностях метода.

4.3.1. Ошибки интерпретации результатов ПЦР Одной из наиболее распространенных ошибок при интерпретации результатов ПЦР-анализа является не принятие во внимание особенностей персистенции и элиминации возбудителя. Например, назначение контрольного исследования через 1 неделю после окончания курса антибиотикотерапии ряда инфекционного заболеваний. В подавляющем большинстве случаев результат анализа на выявление микроорганизма – возбудителя инфекции будет положительным. Из этого можно сделать вывод о неэффективности проведенной терапии. Такое заключение ошибочно в силу того, что ДНК микроорганизма может сохраняться в течение нескольких недель после его элиминации и не свидетельствует о жизнеспособности. Если речь идет о микроорганизмах, ассоциированных с эпителием, окончательный вывод об излеченности, можно сделать не ранее, чем через 5-6 недель после курса антибиотикотерапии. Это срок необходим для смены эпителиального слоя.

С другой стороны, если целью анализа является оценка состояния микрофлоры урогенитального или желудочно-кишечного трактов, то назначение исследования через 1-2 недели на фоне проведенной антибактериальной терапии, скорее всего, приведет к отрицательному результату в ПЦР. В случае сбалансированной и устойчивой системы, ее самовосстановление произойдет не ранее 2 нед. – месяца, тогда проведение ПЦР анализа будет информативным и позволит оценить динамику состояния, либо определить меры коррекции.

Другая ошибка – клиническая оценка положительного результата ПЦР, определение его прогностической значимости. Показано, что только у 40% – 60% лиц с обнаруженной в крови методом ПЦР ДНК цитомегаловируса клинически может развиться заболевание. В данной ситуации при оценке результатов исследования, совершается типичная ошибка, заключающаяся в отождествлении двух принципиально различных понятий – «инфицированность» и «инфекционный процесс».

Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) То же можно сказать и про ПЦР – диагностику инфекций, обусловленных ВПЧ. Метод ПЦР крайне важен с точки зрения возможности идентифицировать отдельные типы ВПЧ (высокого и низкого онкогенного риска). Однако существует большой риск интерпретировать положительный результат с точки зрения прогноза развития неопластических процессов шейки матки, хотя в 80-90 % случаев инфицирование ВПЧ носит кратковременный характер и заканчивается спонтанной элиминацией вируса (через 6-24 месяца). Положительный результат при лабораторном исследовании имеет значимость, если на фоне ВПЧ – инфекции имеется картина неоплазии эпителия шейки матки, что позволяет прогнозировать степень канцерогенного риска.

Еще одной ошибкой является неверная интерпретация результатов количественного ПЦРанализа. В этом случае необходимо четко определить цель назначения данного вида исследования.

Например, опубликованный в 2010 г УДК [616.36-002.12:578.891]-07/08 «Протокол диагностики и лечения больных вирусными гепатитами В и С» регламентирует количественные исследования ДНК вирусного гепатита В и, в соответствии с рекомендациями Европейской ассоциации по изучению печени 2009 г. (EASL Clinical Practice Guidelines 2009), определяет показания для проведения противовирусной терапии HBV при наличии уровня ДНК HBV в крови более 10 000 копий/мл (2000 ME/мл). Сероконверсия по HBeAg в сочетании со снижением уровня ДНК HBV ниже 2000 МЕ/мл (104 копий/мл) расценивается как достижение эффекта терапии.

Однако, проведение количественных исследований методом ПЦР для целого спектра бактериальных и вирусных инфекций на данный момент не регламентировано и не определены критерии диагностической и клинической значимости получаемых результатов. В связи с этим, интерпретация результатов исследования может носить субъективный характер и определять неверную тактику ведения пациента.

Например, количественный анализ отдельных представителей условно-патогенной флоры урогенитального тракта (Ureaplasma, Gardnerella) без учета количественных показателей ведущего представителя нормофлоры – бактерий рода Lactobacillus (обусловливает колонизационную резистентность, поддерживает кислую реакцию среды), а так же при отсутствии клинических проявлений воспаления, дисбиоза и жалоб пациента, может привести к гипердиагностике и необоснованному назначению антибактериальной терапии. Как следствие: стремительный рост антибиотикорезистентности, увеличение числа случаев рецидивирующего бактериального вагиноза и дисбиоза.

Аналогичная ситуация складывается и при интерпретации результатов количественного исследования ВПЧ высокого онкогенного риска. На сегодняшний день отсутствует прямое доказательство роли исходной вирусной нагрузки в развитии неопластических процессов шейки матки и прогнозировании их исхода.

Кроме того, на этапе анализа и интерпретации результатов ПЦР возникают и другие проблемы, которые можно обозначить, как несовпадение результатов при использовании различных методов исследования (например, ПЦР и ИФА, ПЦР и бактериальный посев, ПЦР и микроскопические методы исследования).

4.3.2. Сравнение результатов ПЦР и ИФА В случае сравнения результатов, полученных в ИФА и ПЦР, несовпадения могут быть следующими:

z положительный результат в ПЦР и отрицательный результат в ИФА;

z отрицательный результат ПЦР и положительный результат ИФА.

Ошибки ПЦР В первом случае, и это наиболее актуально для выявления вирусов гепатита С и иммунодефицита человека, данный факт может быть обусловлен наличием «серологического окна». В условиях постоянно повышающихся концентраций антигена в результате репродукции вируса происходит активное снижение концентрации антител за счёт включения их в состав иммунных комплексов «антиген-антитело». Также происходит подавление гуморального звена иммунного ответа в результате синтеза набора цитокинов, стимулирующих клеточное звено иммунитета. Как следствие, в течение инфекционного процесса наблюдается длительное «серологическое окно» от момента заражения до сероконверсии.

Обычно заметное количество антител к ВИЧ появляется в крови через 2-10 недель после заражения, однако разброс во времени может быть весьма велик. Так, у 90-95 % зараженных они обнаруживаются в течение 3-х месяцев после заражения, у 5-9 % – через 6 месяцев, а у 0,5-1 % – и в более поздние сроки.

Выявление ДНК/РНК вируса методом ПЦР позволяет уменьшить продолжительность «серологического окна» в среднем на 11 дней и обнаружить патогена уже через 1-2 недели после заражения.

Проведение ПЦР позволяет выявить РНК вируса гепатита С не только в сыворотке крови, но и в биоптате печени, что важно при подтверждении роли вируса гепатита С в формировании гепатоцеллюлярной карциномы. У подобных больных РНК вируса гепатита С регистрируется в гепатоцитах и при отсутствии anti-HCV и РНК вируса гепатита С – в сыворотке крови. У ряда больных с самоограничивающимся течением инфекции anti-HCV не появляются никогда.

Кроме того, отсутствие положительных результатов ИФА на фоне положительного результата в ПЦР может наблюдаться у иммуносупрессированных пациентов и новорожденных с перинатальной инфекцией (нетипичная картина, связанная с антителами матери). Так, при хроническом хламидиозе до 5% больных имеют титр антихламидийных антител, не превышающий критического уровня.

Аналогичная проблема может возникнуть при диагностике сифилиса, в том случае, если заболевание проходит стадию первичного серонегативного сифилиса, когда стандартные серологические реакции крови еще отрицательные (первые 3-4 недели от возникновения твердого шанкра).

При заболеваниях, передающихся половым путем, скрытый период инфекции, когда уровень иммуноглобулинов не больше нормы, составляет в среднем 14 дней.

Кроме того, важно учитывать возможность высокой генетической изменчивости микроорганизмов, которая приводит к формированию серонегативных штаммов.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Оренбургский государственный университет Кафедра медико-биологической техники А.Д. СТРЕКАЛОВСКАЯ, Н.В. БАЗАРОВА ВЫПОЛНЕНИЕ И ЗАЩИТА КУРСОВЫХ РАБОТ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Рекомендовано к изданию Редакционно-издательским советом государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования – Оренбургский государственный университет Оренбург 2004 ББК...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Уральский государственный университет им. А.М. Горького РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт экологии растений и животных А.Г. Васильев, И. А. Васильева, В.Н. Большаков Феногенетическая изменчивость и методы ее изучения Учебное пособие Утверждено постановлением совета ИОНЦ УрГУ Экология природопользования от.09.2007 для студентов и магистрантов биологического...»

«ФГОС А. А. Елизаров, М. А. Калинина БИОЛОГИЯ УМК для старшей школы 10– 11 классы БАЗОВЫЙ УРОВЕНЬ Методическое пособие для учителя Москва БИНОМ. Лаборатория знаний ВВЕдЕНИЕ В данное пособие входят методические материалы к учебнометодическому комплекту (УМК) по биологии для 10–11 классов авторского коллектива под руководством Т. В. Ивановой. Материалы разработаны на основе требований к результатам освоения основной образовательной программы среднего (полного) общего образования. Предлагаемое...»

«0 Новосибирский городской комитет охраны окружающей среды и природных ресурсов Новосибирский институт повышения квалификации и переподготовки работников образования Институт детства Новосибирского государственного педагогического университета Дворец творчества детей и учащейся молодежи Юниор Средняя общеобразовательная школа Перспектива О. А. Чернухин ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ВОСПИТАНИЕ ШКОЛЬНИКОВ В УСЛОВИЯХ РЕАЛИЗАЦИИ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ СТАНДАРТОВ ВТОРОГО ПОКОЛЕНИЯ Учебно - методическое пособие Новосибирск...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ Национальный аэрокосмический университет им. Н.Е. Жуковского Харьковский авиационный институт В.П. Олейник, С.Н. Кулиш АППАРАТНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ Учебное пособие Харьков “ХАИ” 2004 УДК 616 – 073(075.8) Аппаратные методы исследований в биологии и медицине / В.П. Олейник, С.Н. Кулиш. – Учеб. пособие. – Харьков: Нац. аэрокосм. ун-т “Харьк. авиац. ин-т”, 2004. – 110 с. Рассмотрены группы медико-биологических исследований, основанных...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра ботаники АЛЬГОЛОГИЯ И МИКОЛОГИЯ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ Для студентов I курса дневного отделения специальностей 1-31 01 01 Биология, 1-33 01 01 Биоэкология МИНСК 2009 УДК 582.287.237:630.272(476) ББК 28.591p.я73 A56 А в т о р ы-с о с т а в и т е л и: А. И. Cтефанович, А. К. Храмцов, В. Д. Поликсенова, Н. А. Лемеза, В. В. Карпук, М. А. Стадниченко, М. Н....»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Уральский государственный университет им. А.М. Горького ИОНЦ ЭКОЛОГИЯ И ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЙ факультет кафедра ЭКОЛОГИИ УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ ОСНОВЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО КАРТОГРАФИРОВАНИЯ Методические указания к изучению дисциплины Екатеринбург 2008 Методические указания к изучению дисциплины “Основы экологического картографирования” Курс “Основы...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ЛЕСОТЕХНИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ ЛЕСОВОДСТВО ДИПЛОМНОЕ ПРОЕКТИРОВАНИЕ Методические указания по дипломному проектированию для студентов направления 250100 и специальностей 250201, 560900 Санкт-Петербург 2008 1 Рассмотрены и рекомендованы к изданию методической комиссией лесохозяйственного факультета Санкт-Петербургской государственной лесотехнической академии _200_ г. С о с т а...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Оренбургский государственный университет Кафедра общей биологии Г.П. АЛЁХИНА МИКРОБИОЛОГИЯ С ОСНОВАМИ ВИРУСОЛОГИИ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ Рекомендовано к изданию Редакционно - издательским советом государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Оренбургский государственный университет Оренбург 2003 ББК 28.4:28.3я7...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОУ ВПО МАРИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Ю.А. Александров ОСНОВЫ РАДИАЦИОННОЙ ЭКОЛОГИИ УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ Йошкар-Ола, 2007 ББК 40.1 УДК 631.5 А 46 Рецензенты: Т.М. Быченко, канд. биол. наук, доц. Иркутского гос. пед. ун-та; О.Л. Воскресенская, канд. биол. наук, доц. МарГУ; В.Н. Самарцев, канд. биол. наук, проф. МарГУ Рекомендовано к изданию редакционно-издательским советом МарГУ Александров Ю.А. А 46 Основы радиационной экологии: Учебное пособие /Мар. гос....»

«Российская академия Наук уРальское отделеНие иНститут экологии РастеНий и животНых СОВЕТЫ МОЛОДОМУ УЧЕНОМУ методическое пособие для студентов, аспирантов, младших научных сотрудников и, может быть, не только для них Подготовлено к Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной 50-летию первой молодежной конференции в ИЭРиЖ ЭКОЛОГИЯ: СКВОЗЬ ВРЕМЯ И РАССТОЯНИЕ екатеРиНбуРг 11 – 15 апРеля 2011 г. Российская академия Наук уРальское отделеНие иНститут экологии РастеНий и животНых СОВЕТЫ...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Владимирский государственный университет имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых В. А. Фролов МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕККОМЕНДАЦИИ К СПЕЦКУРСУ ДЛЯ РОДИТЕЛЕЙ ПРОФИЛАКТИКА АЛКОГОЛЬНОЙ, НАРКОТИЧЕСКОЙ, ТОКСИКОМАНИЧЕСКОЙ И ИГРОВОЙ ЗАВИСИМОСТЕЙ СТАРШЕКЛАССНИКОВ В СЕМЬЕ И РЕФЕРЕНТНОЙ ГРУППЕ Владимир 2012 УДК – 371 ББК – 74.00 Ф 91...»

«МИНИСТЕРСТВО СПОРТА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ И СПОРТА МЕЖРЕГИОНАЛЬНАЯ АССОЦИАЦИЯ ПРИКЛАДНОЙ КИНЕЗИОЛОГИИ ПРИКЛАДНАЯ КИНЕЗИОЛОГИЯ В СПОРТЕ ВЫСШИХ ДОСТИЖЕНИЙ Методические рекомендации Москва – 2013 г. УДК 796/799 ББК 75.0 ISBN 978-5-94634-056-4 Васильева Л.Ф. Прикладная кинезиология в спорте высших достижений. Методические рекомендации. – М.: ООО Скайпринт, 2013. – 104 с. В предлагаемых методических рекомендациях представлена прикладная кинезиология, как...»

«Английский язык в сфере промышленного рыболовства : учеб. пособие / сост. : Г.Р. АбдульА 13 манова, О.В. Федорова Астрахан. гос. техн. ун-т. Астрахань Изд-во ; – : АГТУ, 2010. – 152 с. ISBN 978-5-89154-363-8 Предназначено для аудиторной и самостоятельной работы студентов I–III курсов очной, заочной и дистанционной форм обучения, обучающихся по специальности 111001.65 Промышленное рыболовство. Основной целью сборника является овладение навыками чтения текстов профессиональной направленности. В...»

«ПРАВИТЕЛЬСТВО МОСКВЫ ДЕПАРТАМЕНТ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ГОРОДА МОСКВЫ СОГЛАСОВАНО УТВЕРЖДАЮ Заместитель председателя Первый заместитель Ученого медицинского совета руководителя Департамента Департамента здравоохранения города здравоохранения города Москвы Москвы _ _ Проф. Л.Г. Костомарова Н.Ф. Плавунов _ _ 2012 г _ _ 2012 г О ДЕТСКОМ ЦЕРЕБРАЛЬНОМ ПАРАЛИЧЕ ДЛЯ РОДИТЕЛЕЙ ПАЦИЕНТОВ Методические рекомендации № Главный специалист по детской неврологии Департамента здравоохранения Т.Т. Батышева Москва...»

«Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования ГОРНО-АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра зоологии, экологии и генетики Кафедра геоэкологии и природопользования ЭКОЛОГИЯ Учебно-методический комплекс Для студентов, обучающихся по специальности 020401 География Горно-Алтайск РИО Горно-Алтайского госуниверситета 2010 Печатается по решению методического совета Горно-Алтайского госуниверситета УДК – ББК – Авторский знак...»

«Федеральное агентство по образованию Российской Федерации ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра гидрологии и охраны водных ресурсов Е. А. Зилов ГИДРОБИОЛОГИЯ И ВОДНАЯ ЭКОЛОГИЯ: Предмет, методы, цели и задачи, история, терминология гидробиологии Методические указания Иркутск 2006 Рецензент К-т биол. наук О. А. Бархатова Составитель Д-р биол. наук Е. А. Зилов Предназначаются для студентов V курса заочной и IV курса очной форм обучения специальностей 012700 Гидрология и 013400...»

«bbb bbb 0 bb dbb bb ubb sbb bb uub 0 + b b b ddb usb udb dsb ssb 0 b b + b + uuu + + 0 uud uus udd 0 uds uss ddd + dds dss sss Академик Н.Н.Моисеев Основная задача - дать слушателю достаточный объем материала, позволяющий грамотно сориентироваться в проблемах, которые в настоящее время обычно называют экологическими, и которые стали опасными, прежде всего, из-за того, что в оценке своих взаимоотношений с Природой люди скорее склонны изменять Природу, чем свои представления о разумности этих...»

«ПРИОРИТЕТНЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ПРОЕКТ ОБРАЗОВАНИЕ РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ Л.П. СОШЕНКО, А.Г. КУХАРСКАЯ СОВРЕМЕННАЯ ВЕТЕРИНАРНАЯ ГОМЕОПАТИЯ Учебное пособие Москва 2008 1 Инновационная образовательная программа Российского университета дружбы народов Создание комплекса инновационных образовательных программ и формирование инновационной образовательной среды, позволяющих эффективно реализовывать государственные интересы РФ через систему экспорта образовательных услуг Экспертное заключение...»

«1 МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКАЯ АССОЦИАЦИЯ ТРОМБОЗОВ И ГЕМОРРАГИЙ И ПАТОЛОГИИ СОСУДОВ ИМЕНИ А.А.ШМИДТА-Б.А.КУДРЯШОВА. ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Второе издание Москва-2011 2 Лабораторные методы исследования системы свертывания крови: Методические рекомендации АТГПСС им. А.Шмидта-Б.А.Кудряшова. Второе издание.2011 год. Авторы: Сотрудники Первого Московского медицинского университета...»







 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.