WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

«МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ Учебно-методическое пособие для студентов, обучающихся по специальности Ветеринарная медицина, Зоотехния, врачей ветеринарной медицины и слушателей ...»

-- [ Страница 1 ] --

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ

«ВИТЕБСКАЯ ОРДЕНА «ЗНАК ПОЧЕТА» ГОСУДАРСТВЕННАЯ

АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ»

МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

Учебно-методическое пособие

для студентов, обучающихся по специальности «Ветеринарная медицина»,

«Зоотехния», врачей ветеринарной медицины

и слушателей факультета повышения квалификации Витебск

УО ВГАВМ

2010 УДК 619:579.6(07) ББК 48.73 П 69 Жуков А.И., доцент кафедры патанатомии и гистологии УО «ВитебРецензенты:

ская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»;

Иванов В.Н., доцент кафедры внутренних незаразных болезней животных УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины».

Притыченко А.Н.

Р 36 Микроскопический метод исследования. Учебно-методическое пособие для студентов, обучающихся по специальности «Ветеринарная медицина», «Зоотехния», врачей ветеринарной медицины и слушателей факультета повышения квалификации / Притыченко А.Н., Медведев А.П., Вербицкий А.А., Лысенко А.П., Красочко П.А., Алешкевич В.Н., Притыченко А.В., Даровских С.В., Билецкий О.Р., Сахончик П.Е., Лемиш А.П., Архипов И.Н. - Витебск: УО ВГАВМ, 2010. – 100 с.

ISBN 978-985-512-025- Учебно-методическое пособие содержит обобщенные сведения по микроскопическому методу исследований и изложено в соответствии с программой по дисциплине «Микробиология и иммунология» для высших сельскохозяйственных. учебных заведений по специальности 1-74 03 02 «Ветеринарная медицина». Содержит разделы для студентов, обучающихся по специальности «Ветеринарная медицина» и «Зоотехния», врачей ветеринарной медицины и слушателей факультета повышения квалификации.

Пособие предназначено для врачей ветеринарной медицины и ветфельдшеров, работников ветеринарных лабораторий, слушателей факультета повышения квалификации по специальности «Ветеринарная медицина», преподавателей и студентов факультетов ветеринарной медицины, учащихся средних специальных учебных заведений соответствующего профиля и других категорий ветеринарных специалистов.

Рекомендовано к печати редакционно-издательским Советом УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины».





2010 г. (протокол № ).

УДК 619:579.6(07) ББК 48. © Притыченко и др., © УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»,

СОДЕРЖАНИЕ

Введение 1. Историческая справка 2. Возможности микроскопического метода исследования Классификация микроскопов 4. Виды микроскопий 5.

Световая микроскопия 6.

Правила работы с микроскопом и уход за ним 7.

Иммерсионные жидкости 8.

Неисправности, их причины и способы устранения 9.

Микроскопия в темном поле 10.

Основные формулы микроскопии 11.

Фазово-контрастная и аноптральная микроскопия 12.

Интерференционная микроскопия 13.

Поляризационная микроскопия 14.

Люминесцентная микроскопия 15.

16.

Новые возможности современных микроскопов 17.

18.

Телевизионно-компьютерная микроскопия 19.

20.

В микробиологической практике наиболее широкое применение получили такие методы исследования, как микроскопический, бактериологический, биологический и серологический.

Микробиология стала наукой только после разработки в первую очередь микроскопического метода исследования. На её развитие и формирование оказывают влияние многие уникальные методы, однако переоценить роль и значение микроскопии невозможно.

Микроскопы и использование эффективных методов микроскопии определяют основы микробиологии как одного из разделов биологической науки.

Данное учебно-методическое пособие предназначено для тех, кто серьезно изучает микробиологию, нуждается в приобретении навыков, необходимых для проведения исследовательских и прикладных работ. Пособие рассчитано главным образом на студентов очной и заочной форм обучения, начинающих научных работников, стремящихся получить более глубокие знания. Оно будет полезным для преподавателей техникумов и вузов биологического профиля, сотрудников научно-исследовательских учреждений. Пособие содержит полезную информацию для специалистов отраслевых лабораторий и вообще для всех, кого по роду деятельности интересуют проблемы микробиологии.

Литературных источников по микроскопии много, опубликованные по данному вопросу работы весьма разнообразны. В предлагаемом учебнометодическом пособии сконцентрированы необходимые сведения, по видам микроскопий. Большое внимание уделено световой микроскопии, которая является наиболее востребованной в микробиологической практике. Приведена техническая характеристика основных видов микроскопов, изложены правила работы с микроскопом и ухода за ним, указаны причины основных неисправностей и способы их устранения, приведены возможности микроскопического метода исследования, описаны основные принципы и приёмы различных методов микроскопии, их недостатки и преимущества.

Человек с нормальным зрением на оптимальном расстоянии (20 - см) может увидеть в виде точки предмет размером 0,07 - 0,08 мм. Попытки преодолеть поставленный природой барьер были давно. Так, при археологических раскопках в древнем Вавилоне находили двояковыпуклые линзы - самые простые оптические приборы. Обычную лупу, увеличивающую изображение объекта в 10-20 раз, можно считать простейшим микроскопом.





К концу XVII века линзы нашли широкое применение для различных целей. Ещё в XIII веке Роджер Бэкон использовал их в экспериментальной работе.

В 1590 г. шлифовальщики стекол братья Ганс и Захарий Янсены сконструировали прибор из увеличительных линз, позволяющий видеть мельчайшие предметы. В 1609-1610 гг. Г. Галилеем был изготовлен первый простой микроскоп. В 1617-1619 гг. появился двулинзовый микроскоп с выпуклым одиночным объективом и окуляром, изобретателем которого был физик К. Дреббель. Этот микроскоп, усовершенствованный А. Кирхером, был использован для исследования мельчайших живых организмов. С именами А.

Левенгука, Р. Гука, Н. Грю, М. Мальпиги, Я. Сваммердама связано совершенствование конструкции микроскопа и изучение микроскопических объектов – микроорганизмов, клеток растительных и животных тканей.

Первым, кто увидел и описал бактерии, был голландец Антони ван Левенгук (1632-1723), по профессии торговец сукном.

Он сам изготовлял линзы, дающие увеличение в сконструированном им же микроскопе в 160-300 раз.

Рис.2. Микроскоп, сконструированный Антони ван Левенгуком С помощью этого прибора он рассматривал различные настои, слюну, зубной налет, отвар перца, кровь, испражнения и т.д.

Результаты своих наблюдений в форме писем (170) он отсылал в Лондонское королевское общество. В 1695 г. была опубликована его книга «Тайны природы, открытые Антонием Левенгуком».

До нашего времени дошли рисунки А. Левенгука, свидетельствующие об открытии им основных форм микроорганизмов.

Рис.3. Основные формы микроорганизмов, описанные Антони ван Левенгуком Таким образом, А. Левенгук является родоначальником микроскопического метода исследования.

Его труд вызвал живейший интерес у многих ученых, дал толчок изучению микромира. В 1698 г. Петр I, работая на корабельных верфях в Голландии, встречался и беседовал с Левенгуком и привез подаренный им микроскоп в Россию. Производством отечественных микроскопов занимался сначала Иван Беляев, позднее техник-конструктор Иван Кулибин.

В XVIII в. русский академик Л. Эйлер разработал теоретические основы расчетов ахроматических объективов, свободных от хроматической и сферической аберраций, а в 1774 г. был изготовлен такой микроскоп. В г. итальянский ученый Дон Амичи ввел иммерсионный объектив. В 1872 г.

немецкий физик Э. Аббе развивает теорию образования в микроскопе изображения несамосветящихся объектов. В конце XIX в немецким физиком Эрнстом Аббе было установлено, что разрешение (минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно) микроскопа зависит от произведения показателя преломления среды между предметом и объективом на синус апертурного угла. Величина получила название числовой апертуры (она обозначается символом NA). Чем больше NA и чем меньше длина волны, тем меньше детали исследуемого объекта.

Для увеличения числовой апертуры объективов в микроскопии пространство между объективом и покровным стеклом заполняют иммерсионной жидкостью Кроме разрешающей способности системы, числовая апертура характеризует светосилу объектива: интенсивность света, приходящаяся на единицу площади изображения, приблизительно равна квадрату NA. Величина NA составляет примерно 0,95 для хорошего объектива. Микроскоп обычно рассчитывают таким образом, чтобы его полное увеличение составляло около 1000 NA.

Эти работы послужили основой для дальнейшего конструирования объективов и осветительных систем.

В настоящее время бактериологические лаборатории снабжены микроскопами различных типов: МБР-1, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-6, «Биолам», серии «Люмам» (Р-1, Р-2, Р-3 – модели рабочего типа, И-1, И-2, И-3 – модели исследовательского типа), бинокулярными МБР-3, «Биолам» С-3, «Биолам» Р- и др.

Наиболее совершенные модели, например, МИКРОМЕД-2 вариант 2имеют приспособления для фотографирования, фазово-контрастного и темнопольного микроскопирования.

Однако разрешающая способность световых микроскопов не безгранична и зависит от числовой апертуры и длины волны используемого света.

Впервые (1934) явление фазовоконтрастности было подмечено голландским физиком Ф. Цернике.

Неокрашенные препараты не поглощают свет, они изменяют фазу световых волн, которые не видны глазом человека. Ф. Цернике изменил фазу световой волны и сделал её видимой путем нанесения на линзу фазовоконтрастного объектива, кольцеобразного серого слоя.

В 1953 г. финским физиологом А. Вильска предложен аноптральный микроскоп, который является дальнейшим усовершенствованием фазовоконтрастного прибора, затем в 1955 г. М.А. Пешковым и в 1960 г. С.Б. Стефановым аноптральный микроскоп был усовершенствован.

Первый люминесцентный микроскоп сконструирован в 1908 г. А. Кёлером и Г. Зидентопфом.

Новый этап в развитии микроскопии начался с тех пор, как была открыта возможность использования вместо видимого света потока движущихся электронов.

Первый электронный микроскоп был сконструирован в 1932 г. в Германии М. Кноллем и Э. Руска. В 1986 г. Э. Руска удостоен Нобелевской премии. В Советском Союзе конструирование электронных микроскопов началось в 1937 г. В 1939 г. в ряде стран появились заводские образцы этих приборов, которые имели разрешающую способность до 20, а к 1946-1947 гг. – до 15-8,5 ангстрем. В настоящее время известны микроскопы с еще более высокой степенью разрешения.

3. Возможности микроскопического метода исследования Микроскопия (греч. micros-малый, skopo-смотрю) - совокупность методов зрительного исследования микрообъектов при увеличении их от нескольких десятков до сотен тысяч раз. Сущность микроскопического метода исследования заключается в изучении микроорганизмов с помощью микроскопов различных типов и методов микроскопии (световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, аноптральная, поляризационная, электронная и др.).

Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

Микроскопический метод исследования позволяет изучить, в первую очередь, морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов, т.е.

их размер, форму, взаимное расположение, наличие спор, капсул, жгутиков, клеточных включений, окрашиваемость бактерий различными методами, их кислотоустойчивость. Применение этого метода позволяет учитывать результаты реакции микроагглютинации (РМА), в отдельных случаях реакции агглютинации (РА), судить об однородности (или разнородности) микробных клеток, в определенной степени о чистоте изучаемой культуры и др.

Микроскопический метод можно использовать для исследования живых бактерий: наличия подвижности, особенностей их движения и тем самым ориентировочной дифференциации микроорганизмов.

С помощью микроскопии (интерференционной) можно получать данные о сухом весе клеточных культур, концентрации вещества и воды в клетке, толщине структур.

Рис. 5. Современный световой микроскоп (Микромед 2, вариант 2-20) Микроскопический метод исследования позволяет обнаруживать и устанавливать локализацию микробов в органах и тканях, исследовать жизненные процессы бактерий, выявлять их люминесценцию, получать фотографии микроорганизмов и их фрагментов в цветном и черно-белом изображении, при наличии специфических люминесцирующих сывороток определять вид микроорганизмов. Самым большим практическим достоинством метода является возможность с его помощью проводить быструю (в течение 1-3 часов) ориентировочную диагностику инфекционной болезни.

Стереомикроскопы применяются в лабораториях и на различных производствах для получения увеличенных изображений объектов во время проведения рабочих операций. Возможна работа в отраженном и проходящем свете.

Современные световые микроскопы (МИКРОМЕД-2, вариант 2-20, рис.2) предназначен для наблюдения и морфологических исследований препаратов в проходящем свете по методу светлого поля, а также по методу темного поля (с конденсором темного поля) и по методу фазового контраста (с фазово-контрастным устройством), дополнительно может комплектоваться видеоокуляром и программным обеспечением для микрофотографирования и микросъёмки.

1. По строению оптической системы:

• прямые микроскопы, названные так благодаря классическому, со времен создания первых микроскопов, взаимному расположению объекта исследования и оптики для наблюдения. В прямых микроскопах объективы, насадка и окуляры расположены над объектом • инвертированные микроскопы, расположение объекта и наблюдательной оптики обращено по сравнению с прямыми микроскопами. Объект находится над оптической системой, формирующей изображение • стереомикроскопы, содержащие в своей оптической схеме два расположенных под углом друг к другу микроскопа, формирующих объемное изображение объекта. Так же, как и в прямых микроскопах, объект в стереомикроскопах располагается под оптической системой, формирующей изображение 2. По способам освещения:

• проходящего света, в которых изображение формируется светом, проходящим через объект • падающего (отраженного) света, изображение формируется отраженным от поверхности объекта светом 3. По методам контраста:

• светлого поля, на светлом фоне выделяется более темный объект • темного поля, на темном фоне выделяется светлый объект или его краевые структуры • фазового контраста, на светло-сером фоне наблюдается темно-серый рельефный объект (в случае оптической схемы отрицательного фазового контраста изображение будет негативным, объект практически всегда сильно оконтурен) • флюоресценции (люминесценции), на темном фоне выделяются светящиеся объекты или части объекта;

• поляризованного света, наблюдается ярко окрашенное в различные цвета или оттенки изображение объекта;

Световая микроскопия - предполагает использование световых микроскопов для решения различных задач.

Стереоскопическая микроскопия - предназначена для получения трехмерного изображения объекта при помощи стереоскопического бинокулярного микроскопа (рис.6). Он состоит из двух отдельных микроскопических систем. Прибор обеспечивает небольшое увеличение (до 100). Такие микроскопы используются при сборке миниатюрных электронных компонентов, техническом контроле, хирургических операциях.

Рис.6. Стереоскопический микроскоп Поляризационная микроскопия - применяется для изучения взаимодействия образцов с поляризованным светом. Нередко при помощи поляризованного света удается выявлять структуру объектов, лежащую за пределами обычного оптического разрешения.

Отражательная микроскопия - предполагает использование отражательных микроскопов, в которых вместо линз зеркала формируют изображение. Так как изготовление зеркального объектива – задача трудная, то полностью отражательных микроскопов очень мало. Поэтому зеркала в настоящее время применяются в основном лишь в приставках, например, для микрохирургии отдельных клеток.

Люминесцентная микроскопия - с помощью системы светофильтров люминесцентного микроскопа освещает образец ультрафиолетовым или синим светом. Поглощая это излучение, образец испускает видимый свет люминесценции. Люминесцентные микроскопы широко используются в биологии, а также в медицине.

Темнопольная микроскопия - применяется для получения изображений прозрачных живых объектов, используя обычный световой микроскоп с темнопольным конденсором. Образец в нем рассматривается при столь «косом» освещении, что прямой свет не имеет возможности попасть в объектив.

Изображение формируется светом, дифрагированным на объекте, и в результате объект выглядит очень светлым на темном фоне (с очень большим контрастом).

Фазово-контрастная микроскопия - применяется для исследования изображений прозрачных объектов, особенно живых клеток. При помощи специальных устройств часть света, проходящего через микроскоп, сдвигается по фазе на половину длины волны относительно другой части, благодаря чему достигается контрастное изображение.

Интерференционная микроскопия - это модификация фазовоконтрастной микроскопии. Каждый луч, входящий в микроскоп, раздваивается. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, а второй - мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. При таком методе получаются окрашенные изображения, дающие очень ценную информацию при исследовании живого материала.

Рентгеновская микроскопия - это совокупность методов исследования изображений микрообъектов с применением рентгеновского излучения.

В этих методах используют специальные приборы, испускающие рентгеновское излучение, которое на 2 - 3 порядка меньше длины волны видимого света. Поэтому предел разрешения у рентгеновских микроскопов может быть на 2 - 3 порядка выше, чем у световых.

Микроскоп – оптический прибор, предназначенный для получения сильно увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), невидимых невооружённым глазом.

В отличие от лупы, микроскоп имеет, как минимум, две ступени увеличения. Функциональные и конструктивно-технологические части микроскопа предназначены для обеспечения работы микроскопа и получения устойчивого, максимально точного, увеличенного изображения объекта.

Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность, общее увеличение и контраст. Разрешающая способность - это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0,2 мм.

Общее увеличение - это произведение собственного увеличения окуляра и объектива. Современные световые микроскопы позволяют достигнуть увеличения не более чем в 2000 раз.

Контраст изображения - это различие яркостей изображения и фона.

Если это различие составляет менее 3 - 4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой, изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча. Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света - цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны - изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

Микроскоп состоит из четырёх частей: механической, оптической (осветительной), воспроизводящей и визуализирующей (рис. 7, 8).

ПРЕПАРАТОВОДИТЕЛЯ

ТУБУСОДЕРЖАТЕЛЬ

ОКУЛЯРЫ

БИНОКУЛЯР

РЕВОЛЬВЕР

ОБЪЕКТИВЫ

ПРЕДМЕТНЫЙ

СТОЛИК

ПРЕПАРАТОВОДИТЕЛЬ

КОНДЕНСОР

ИСТОЧНИК СВЕТА

МАКРОВИНТ

МИКРОВИНТ

ШТАТИВ

ВИЗУАЛИЗИРУЮЩАЯ

ВОСПРОИЗВОДЯЩАЯ

ЧАСТЬ

МЕХАНИЧЕСКАЯ

ОСВЕТИТЕЛЬНАЯ

ЧАСТЬ Рис. 8. Составные части современного микроскопа К механической части относят штатив, состоящий из основания и тубусодержателя, предметный столик, коробку механизмов с макро- и микрометрическими винтами.

Чисто механическим узлом микроскопа является предметный столик, предназначенный для крепления или фиксации в определенном положении объекта наблюдения. Столики бывают неподвижные, координатные и вращающиеся (центрируемые и нецентрируемые).

Оптическая часть микроскопа состоит из основного оптического узла (объектив и окуляр) и вспомогательной осветительной системы (зеркало и конденсор). Отдельные типы микроскопов имеют вмонтированный в подошву искусственный источник света (электролампу) или же снабжены специальными осветительными аппаратами (ОИ-7, ОИ-9, ОИ-19 и др.). Разделение частей микроскопа на механическую и оптическую характерно для старых образцов микроскопов (МБР-1, МБИ-1, «Биолам» Р-1 и др.).

Осветительная часть предназначена для создания светового потока, который позволяет осветить объект таким образом, чтобы последующие части микроскопа предельно точно выполняли свои функции. Осветительная часть микроскопа проходящего света расположена за объектом под объективом в прямых микроскопах и перед объектом над объективом в инвертированных.

Осветительная часть включает источник света (лампа и электрический блок питания) и оптико-механическую систему (коллектор, конденсор, полевая и апертурная регулируемые/ирисовые диафрагмы).

Воспроизводящая часть предназначена для воспроизведения объекта в плоскости изображения с требуемым для исследования качеством изображения и увеличения (т.е. для построения такого изображения, которое как можно точнее и во всех деталях воспроизводило бы объект с соответствующим оптике микроскопа разрешением, увеличением, контрастом и цветопередачей). Воспроизводящая часть обеспечивает первую ступень увеличения и расположена после объекта до плоскости изображения микроскопа.

Воспроизводящая часть включает объектив и промежуточную оптическую систему. Современные микроскопы последнего поколения базируются на оптических системах объективов, скорректированных на бесконечность.

Это требует дополнительно применения так называемых тубусных систем, которые параллельные пучки света, выходящие из объектива, «собирают» в плоскости изображения микроскопа.

Визуализирующая часть предназначена для получения реального изображения объекта на сетчатке глаза, фотопленке или пластинке, на экране телевизионного или компьютерного монитора с дополнительным увеличением (вторая ступень увеличения).

Визуализирующая часть расположена между плоскостью изображения объектива и глазами наблюдателя (камерой, фотокамерой).

Визуализирующая часть включает монокулярную, бинокулярную или тринокулярную визуальную насадку с наблюдательной системой (окулярами, которые работают как лупа). Кроме того, к этой части относятся системы дополнительного увеличения (системы оптовара/смены увеличения); проекционные насадки, в том числе дискуссионные для двух и более наблюдателей;

рисовальные аппараты; системы анализа и документирования изображения с соответствующими адаптерными (согласующими) элементами.

Основным конструктивно-механическим блоком микроскопа является штатив. Штатив включает в себя следующие основные блоки: основание и тубусодержатель.

Основание или штатив (см. рис.7) представляет собой блок, на котором крепится весь микроскоп. В простых микроскопах на основание устанавливают осветительные зеркала или накладные осветители. В более сложных моделях осветительная система встроена в основание без или с блоком питания.

6.1.1. Разновидности оснований микроскопа:

а) основание с осветительным зеркалом (микроскоп типа МИКМЕД-1);

б) основание с так называемым «критическим» или упрощенным освещением (микроскоп типа МИКМЕД-1, вариант 2 - 6);

в) основание с освещением по Кёлеру (микроскоп типа МИКМЕД-2).

Рис.9. Разновидности оснований микроскопа Тубусодержатель (см. рис.7) представляет собой блок, на котором закрепляются:

узел смены объективов, имеющий следующие варианты исполнения - револьверное устройство, резьбовое устройство для ввинчивания объектива, «салазки» для безрезьбового крепления объективов с помощью специальных направляющих;

фокусировочный механизм грубой и точной настройки микроскопа на резкость - механизм фокусировочного перемещения узел крепления сменных предметных столиков;

узел крепления, а также фокусировочного и центрировочного перемещения конденсора;

узел крепления сменных насадок (визуальных, фотографических, телевизионных, различных передающих устройств).

В микроскопах могут использоваться стойки для крепления узлов (например, фокусировочный механизм в стереомикроскопах или крепление осветителя в некоторых моделях инвертированных микроскопов).

Оптические узлы и принадлежности обеспечивают основную функцию микроскопа — создание увеличенного изображения объекта с достаточной степенью достоверности по форме, соотношению размеров составляющих элементов и цвету. Кроме этого, оптика должна обеспечивать такое качество изображения, которое отвечает целям исследования и требованиям методик проводимого анализа.

Основными оптическими элементами микроскопа (см. рис.7) являются оптические элементы, конденсор, окуляры и др.

Объективы микроскопа (см рис.10) представляют собой оптические системы, предназначенные для построения микроскопического изображения в плоскости изображения с соответствующим увеличением, разрешением элементов, точностью воспроизведения по форме и цвету объекта исследования. Они имеют сложную оптико-механическую конструкцию, которая включает несколько одиночных линз и компонентов, склеенных из 2-х или 3х линз. Количество линз обусловлено кругом решаемых объективом задач.

Чем выше качество изображения, даваемое объективом, тем сложнее его оптическая схема. Общее число линз в сложном объективе может доходить до 14 (например, это может относиться к планапохроматическому объективу с увеличением 100 и числовой апертурой 1,40).

Объектив состоит из фронтальной и последующей частей. Фронтальная линза (или система линз) обращена к препарату и является основной при построении изображения соответствующего качества, определяет рабочее расстояние и числовую апертуру объектива. Последующая часть в сочетании с фронтальной обеспечивает требуемое увеличение, фокусное расстояние и качество изображения, а также определяет высоту объектива и длину тубуса микроскопа.

Классификация объективов значительно сложнее классификации микроскопов. Объективы разделяются по принципу расчетного качества изображения, параметрическим и конструктивно-технологическим признакам, а также по методам исследования и контрастирования.

ОПТИКОВЫХОДНЫЕ

МЕХАНИЧЕКИЕ

ПАРАМЕТРЫ:

увеличение числовая апертура рабочее расстояние линейное поле

ТИП ОПТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКТИВНЫЕ

КОРРЕКЦИИ: ОСОБЕННОСТИ:

КОНСТРУКТОРСКОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ

ОСОБЕННОСТИ:

По принципу расчетного качества изображения объективы могут быть ахроматическими, апохроматическими, объективами плоского поля (план).

Ахроматические объективы. Рассчитаны для применения в спектральном диапазоне 486 - 656 нм. Исправление любой аберрации (ахроматизация) выполнено для двух длин волн. В этих объективах устранены сферическая аберрация, хроматическая аберрация положения, кома, астигматизм и частично - сферохроматическая аберрация. Изображение объекта имеет несколько синевато-красноватый оттенок.

Апохроматические объективы. Имеют расширенную спектральную область, и ахроматизация выполняется для трех длин волн. При этом, кроме хроматизма положения, сферической аберрации, комы и астигматизма, достаточно хорошо исправляются также вторичный спектр и сферохроматическая аберрация, благодаря введению в схему линз из кристаллов и специальных стекол. По сравнению с ахроматами, эти объективы обычно имеют повышенные числовые апертуры, дают четкое изображение и точно передают цвет объекта.

Современные объективы, обладающие промежуточным качеством изображения - полуапохроматы, носят название микрофлюары.

Планобъективы. В планобъективах исправлена кривизна изображения по полю, что обеспечивает резкое изображение объекта по всему полю наблюдения. Планобъективы обычно применяются при фотографировании, причем наиболее эффективно применение планапохроматов.

Потребность в подобного типа объективах возрастает, однако они достаточно дороги из-за оптической схемы, реализующей плоское поле изображения, и применяемых оптических сред. Поэтому рутинные и рабочие микроскопы комплектуются так называемыми экономичными объективами. К ним относятся объективы с улучшенным качеством изображения по полю:

ахростигматы (фирма LEICA), СР-ахроматы и ахропланы (фирма CARL ZEISS), стигмахроматы (фирма ЛОМО).

По параметрическим признакам объективы делятся следующим образом:

объективы с конечной длиной тубуса (например, 160 мм) и объективы, скорректированные на длину тубуса «бесконечность» (например, с дополнительной тубусной системой, имеющей фокусное расстояние 160 мм);

объективы малых (до 10х); средних (до 50х) и больших (более 50х) увеличений, а также объективы со сверхбольшим увеличением (свыше 100 х);

объективы малых (до 0,25), средних (до 0,65) и больших (более 0,65) числовых апертур, а также объективы с увеличенными (по сравнению с обычными) числовыми апертурами (например, объективы апохроматической коррекции, а также специальные объективы для люминесцентных микроскопов);

объективы с увеличенными (по сравнению с обычными) рабочими расстояниями, а также с большими и сверхбольшими рабочими расстояниями (объективы для работы в инвертированных микроскопах). Рабочее расстояние - это свободное расстояние между объектом (плоскостью покровного стекла) и нижним краем оправы (линзы, если она выступает) фронтального компонента объектива;

объективы, обеспечивающие наблюдение в пределах нормального линейного поля (до 18 мм); широкопольные объективы (до 22,5 мм);

сверхширокопольные объективы (более 22,5 мм);

объективы стандартные (45 мм, 33 мм) и нестандартные по высоте. Высота - расстояние от опорной плоскости объектива (плоскости соприкосновения ввинченного объектива с револьверным устройством) до плоскости предмета при сфокусированном микроскопе, является постоянной величиной и обеспечивает парфокальность комплекта аналогичных по высоте объективов разного увеличения, установленных в револьверном устройстве.

Иными словами, если с помощью объектива одного увеличения получить резкое изображение объекта, то при переходе к последующим увеличениям изображение объекта остается резким в пределах глубины резкости объектива.

По конструктивно-технологическим признакам существует следующее разделение:

объективы, имеющие пружинящую оправу (начиная с числовой апертуры 0,50), и без нее;

объективы, имеющие ирисовую диафрагму внутри для изменения числовой апертуры (например, в объективах с увеличенной числовой апертурой, в объективах проходящего света для реализации метода темного поля, в поляризационных объективах отраженного света);

объективы с корректирующей (управляющей) оправой, которая обеспечивает движение оптических элементов внутри объектива (например, для корректировки качества изображения объектива при работе с различной толщиной покровного стекла или с различными иммерсионными жидкостями; а также для изменения увеличения при плавной - панкратической - смене увеличения) и без нее.

По обеспечению методов исследования и контрастирования объективы можно разделить следующим образом:

объективы, работающие с покровным и без покровного стекла;

объективы проходящего и отраженного света (безрефлексные);

люминесцентные объективы (с минимумом собственной люминесценции);

поляризационные объективы (без натяжения стекла в оптических элементах, т. е. не вносящие собственную деполяризацию); фазовые объективы (имеющие фазовый элемент - полупрозрачное кольцо внутри объектива); объективы ДИК работающие по методу дифференциальноDIC), интерференционного контраста (поляризационные с призменным элементом); эпиобъективы (объективы отраженного света, предназначенные для обеспечения методов светлого и темного поля, имеют в конструкции специально рассчитанные осветительные эпизеркала);

иммерсионные и безыммерсионные объективы.

Иммерсионные объективы. Качество изображения, параметры и оптическая конструкция иммерсионных объективов рассчитываются и выбираются с учетом толщины слоя иммерсии, которая рассматривается как дополнительная линза с соответствующим показателем преломления. Иммерсионная жидкость, расположенная между объектом и фронтальным компонентом объектива, увеличивает угол, под которым рассматривается объект (апертурный угол). Числовая апертура безыммерсионного (сухого) объектива не превышает 1,0 (разрешающая способность порядка 0,3 мкм для основной длины волны); иммерсионного - доходит до 1,40 в зависимости от показателя преломления иммерсии и технологических возможностей изготовления фронтальной линзы (разрешающая способность такого объектива порядка 0, мкм).

Иммерсионные объективы больших увеличений имеют короткое фокусное расстояние - 1,5 - 2,5 мм при свободном рабочем расстоянии 0,1 - 0, мм (расстояние от плоскости препарата до оправы фронтальной линзы объектива).

Данные о каждом объективе маркируются на его корпусе с указанием следующих параметров:

увеличение («х»-крат, раз): 8х, 40х, 90х;

числовая апертура: 0,20; 0,65, пример: 40/0,65 или 40х/0,65;

дополнительная буквенная маркировка, если объектив используется при различных методах исследования и контрастирования: фазовый - Ф (Рп2 - цифра соответствует маркировке на специальном конденсоре или вкладыше), поляризационный - П (Pol), люминесцентный - Л (L), фазоволюминесцентный - ФЛ (PhL), ЭПИ (Epi, HD) - эпиобъектив для работы в отраженном свете по методу темного поля, дифференциально-интерференционный контраст - ДИК (DIC), пример: 40х/0,65 Ф или Ph2 40x/0,65;

маркировка типа оптической коррекции: апохромат - АПО (АРО), планахромат - ПЛАН (PL, Plan), планапохромат - ПЛАН-АПО (Plan-Аро), улучшенный ахромат, полуплан - СХ - стигмахромат (Achrostigmat, CPachromat, Achroplan), микрофлюар (полуплан-полуапохромат) - СФ или МФЛЮАР (MICROFLUAR, NEOFLUAR, NPL, FLUOTAR), пример:

ПЛАН-АПО или Plan-Apo 40х/0,65 Ф Ph2 40х/0, длина тубуса (160 или - «бесконечность») и через косую черту указывается толщина покровного стекла (0,17; 0 или «-», последнее указывается, если объектив работает как с покровным, так и без покровного стекла), пример:

ПЛАН-АПО или Plan-Apo 40х/0,65 Ф Ph2 40x/0, 160/0, тип иммерсии с обязательной маркировкой цветным кольцом, расположенным ближе к фронтальному компоненту - МИ (oil) - черное кольцо, ВИ (W) - белое кольцо, ГИ (Glyc) - оранжевое кольцо, пример:

ПЛАН-АПО или Plan-Apo 40х/0,65 миФ Ph2 40x/0,65 oil 160/0, фирма-изготовитель, заводской номер или децимальный номер по каталогу.

Оптические системы, предназначенные для построения микроскопического изображения на сетчатке глаза наблюдателя. В общем виде окуляры состоят из двух групп линз: глазной - ближайшей к глазу наблюдателя - и полевой - ближайшей к плоскости, в которой объектив строит изображение рассматриваемого объекта. Окуляры классифицируются по тем же группам признаков, что и объективы:

окуляры компенсационного (К - компенсируют хроматическую разность увеличения объективов свыше 0,8%) и безкомпенсационного действия;

окуляры обычные и плоского поля (PL);

окуляры широкоугольные (с окулярным числом - произведение увеличения окуляра на его линейное поле - более 180); сверхширокоугольные (с окулярным числом более 225);

окуляры с вынесенным зрачком для работы в очках и без;

окуляры для наблюдения, проекционные, фотоокуляры, гамалы;

окуляры с внутренней наводкой (с помощью подвижного элемента внутри окуляра происходит настройка на резкое изображение сетки или плоскость изображения микроскопа; а также плавное, панкратическое изменение увеличения окуляра) и без нее.

Окуляры Гюйгенса - простейшие окуляры, состоящие, как минимум, из 2-х линз.

Маркировка окуляра. Современная маркировка окуляров предусматривает кроме указания линейного увеличения окуляра, размер видимого поля изображения (линейное поле в мм): х/18. Маркировка наносится на фронтальную (переднюю) часть окуляра или по верхней образующей корпуса окуляра.

Там же маркируются дополнительные сведения: работа в очках (символом в виде очков), «foe.» - фокусировочный (передвижной) элемент внутри окуляра для наводки на резкость изображения сетки окуляра, тип коррекции («Р1») или компенсация хроматической разности увеличения («К»).

Осветительная система микроскопа представляет собой систему линз, диафрагм и зеркал (последние применяются при необходимости), обеспечивающую равномерное освещение объекта и полное заполнение апертуры объектива.

Осветительная система микроскопа проходящего света состоит из двух частей - коллектора и конденсора.

Коллектор. При встроенной осветительной системе проходящего света коллекторная часть расположена вблизи источника света в основании микроскопа и предназначена для увеличения размера светящегося тела. Для обеспечения настройки коллектор может быть выполнен подвижным и перемещаться вдоль оптической оси. Вблизи коллектора располагается полевая диафрагма микроскопа.

Конденсор (см. рис.7). Оптическая система конденсора предназначена для увеличения количества света, поступающего в микроскоп. Конденсор располагается между объектом (предметным столиком) и осветителем (источником света). Чаще всего в учебных и простых микроскопах конденсор может быть выполнен несъемным и неподвижным. В остальных случаях конденсор является съемной частью и при настройке освещения имеет фокусировочное перемещение вдоль оптической оси и центрировочное перемещение, перпендикулярное оптической оси. При конденсоре всегда находится осветительная апертурная ирисовая диафрагма.

Конденсор является одним из основных элементов, обеспечивающих работу микроскопа по различным методам освещения и контрастирования:

косое освещение (диафрагмирование от края к центру и смещение осветительной апертурной диафрагмы относительно оптической оси микроскопа);

темное поле (максимальное диафрагмирование от центра к краю осветительной апертуры);

фазовый контраст (кольцевое освещение объекта, при этом изображение светового кольца вписывается в фазовое кольцо объектива).

Классификация конденсоров близка по группам признаков к объективам:

конденсоры по качеству изображения и типу оптической коррекции делятся на неахроматические, ахроматические, апланатические и ахроматические-апланатические;

конденсоры малой числовой апертуры (до 0,30), средней числовой апертуры (до 0,75), большой числовой апертуры (свыше 0,75);

конденсоры с обычным, большим и сверхбольшим рабочим расстоянием;

обычные и специальные конденсоры для различных методов исследования и контрастирования;

конструкция конденсора - единая, с откидным элементом (фронтальным компонентом или линзой большого поля), со свинчивающимся фронтальным элементом.

Конденсор Аббе - не исправленный по качеству изображения конденсор, состоящий из 2-х неахроматических линз: одной - двояковыпуклой, другой - плосковыпуклой, обращенной к объекту наблюдения (плоская сторона этой линзы направлена вверх). Апертура конденсора А= 1,20. Имеет ирисовую диафрагму.

Апланатический конденсор - конденсор, состоящий из трех линз, расположенных следующим образом: верхняя линза — плосковыпуклая (плоская сторона направлена к объективу), далее следуют вогнуто-выпуклая и двояковыпуклая линзы. Исправлен в отношении сферической аберрации и комы. Апертура конденсора А = 1,40. Имеет ирисовую диафрагму.

Ахроматический конденсор - конденсор, полностью исправленный в отношении хроматической и сферической аберрации.

Конденсор темного поля - конденсор, предназначенный для получения эффекта темного поля. Может быть специальным или переделан из обычного светлопольного конденсора путем установки в плоскости ирисовой диафрагмы конденсора непрозрачного диска определенного размера.

Маркировка конденсора. На фронтальной части конденсора наносится маркировка числовой апертуры (осветительной).

6.5.1. Пример расчета полезного увеличения и подбора оптики при Объектив 90x1,25 МИ; бинокулярная насадка АУ-12, имеющая собственное увеличение 1,5х, числовая апертура объектива — Ао6 = = 1,25.

Нижний предел увеличения микроскопа должен быть: 500x1,25 = 625.

Верхний предел увеличения микроскопа должен быть: 1000x1,25= 1250. Общее увеличение объектива и бинокулярной насадки: 90х 1,5 = 135.

Таким образом, минимальное увеличение окуляра будет: 625: 135 = 4,6х, а максимальное увеличение — 1250: 135 = 9,2 х.

РЕЗЮМЕ: для работы с объективом 90х в условиях, например, микроскопа БИОЛАМ необходимо иметь окуляры 5х и 10х, в том числе и 7х.

В микроскопах нового поколения, например, ЕС БИМАМ Р увеличение объектива с масляной иммерсией — 100x1,25, бинокуляр имеет увеличение х. В таком случае пределы увеличения могут быть: 500x1,25 = 625;

1000x1,25=1250, следовательно, минимальное увеличение окуляра будет : 100 = 6,25х, максимальное — 1250:100 = 12,5х.

РЕЗЮМЕ: для работы с объективом 100х в условиях микроскопа ЕС БИМАМ Р (МИКРОМЕД-2), необходимо иметь окуляры 6,3х и 12,5х, в том числе 7х и 10х.

Увеличение объектива. При конечной длине тубуса (например, мм) увеличение объектива является исходным и определяется следующим образом: Fоб = Д.Т. /Fo6=160/Fo6, где Д.Т. — механическая длина тубуса, Fоб — фокусное расстояние объектива. Определяющим для расчета увеличения объектива, скорректированного на «бесконечность», является фокусное расстояние тубусной линзы или системы и фокусное расстояние самого объектива: об = Fт.л. / Fоб, где Рт.л. — фокусное расстояние тубусной линзы.

Увеличение окуляра определяется по формуле: ГoK = 250/FOK, где 250 — расстояние наилучшего видения в мм, Fok — фокусное расстояние окуляра.

Поле на предмете. Поле на предмете рассчитывается с учетом линейного поля окуляра и увеличения объектива, а также дополнительных оптических элементов, которые имеют увеличение и расположены до окуляра внутри микроскопа. Выше приведены размеры линейных полей окуляров в микроскопах БИОЛАМ, МИКРОМЕД-2.

Например, линейное поле широкопольного окуляра 10х равно 18 мм, при работе с монокулярной насадкой и объективом 40 х линейное поле на предмете будет составлять: 18 мм:40х = = 0,45 мм; при работе с бинокулярной насадкой АУ-12, увеличение которой 1,5х, с тем же объективом поле на предмете будет: 18 мм: 40: 1,5 = 0,21 мм.

Числовая апертура объектива (А) — произведение синуса половины апертуры на показатель преломления среды между предметом и объективом:

А = n – sin (u/2), где п — показатель преломления среды, лежащей между объектом наблюдения и объективом, u — апертурный угол.

Числовая апертура определяет ряд важнейших свойств микроскопа: яркость изображения, «проникающую» и «отображающую» способности, т.е.

степень сходства изображения с предметом. Чем больше числовая апертура, тем более мелкие подробности в состоянии воспроизводить объектив.

Разрешающая способность — это способность глаза или оптического прибора различать мелкие детали, наименьшее расстояние между изображениями двух соседних точек (линий), которые различаются как два отдельных изображения. Для нормального глаза предельное угловое разрешение составляет около 1', что соответствует 0,0045 мм на сетчатке.

Волновые свойства света определяют предел разрешения в оптических приборах. По дифракционной теории образования изображения в световом микроскопе Аббе нельзя видеть объекты меньше полудлины волны и нельзя получить изображение меньше полудлины волны d 0,5 (0/А), где d — разрешающая способность микроскопа, мкм, — длина волны, мкм, А — числовая апертура объектива.

6.6. Основные технические характеристики светового микроскопа Современные микроскопы имеют ряд характеристик, указывающих на их технические возможности.

К основным техническим характеристикам светового микроскопа относят его общее увеличение и разрешающую способность.

Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов - 10, 40 и 100.

Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1000.

Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается. Напротив, качество изображения ухудшается.

Коэффициент увеличения микроскопа, т.е. его общее увеличение определяют как произведение увеличений окуляра и объектива: например, окуляр х15 и объектив х90 – общее увеличение составит 1350 раз (15х90=1350).

Теоретически микроскоп может дать увеличение более, чем в 2000 раз.

Однако необходимо различать полезное и бесполезное увеличение прибора.

Предел полезного увеличения обычных микроскопов не превышает 1400.

Увеличение, которое дает возможность рассматривать объект под предельным углом зрения – есть полезное увеличение. Оно обычно превышает числовую апертуру объектива в 500-1000 раз. Например, для объектива с увеличением х40, имеющего числовую апертуру 0,65, полезное увеличение составляет 325-650 (0,65х500=325; 0,65х1000=650). Следовательно, для объектива х40 следует брать окуляр х15, чтобы получить общее увеличение в пределах полезного.

Если объектив имеет увеличение х90 (числовая апертура 1,25), то полезное увеличение для него равно х1250 (1,25х1000). Чтобы не выходить за пределы полезного увеличения, применять окуляры с увеличением более чем х15, не следует. Таким образом, сильные окуляры не следует применять, более тонких деталей структур выявить не удается.

Весьма важной характеристикой микроскопа является его разрешающая способность. Увеличительная способность микроскопа зависит от объектива и окуляра, а разрешающая способность определяется главным образом объективом и конденсором. Разрешающая способность микроскопа определяется по формуле:

Д – разрешающая способность прибора;

l – длина световой волны;

А – числовая апертура микроскопа.

Например, если применять объектив х 40, числовая апертура его 0,65, длина световой волны 0,55, то Д будет равно 0,42 мкм, т.е.:

Разрешающая способность микроскопа тем выше, чем меньше ее абсолютная величина. Максимальная разрешающая способность светового микроскопа 0,2 мкм.

Штатив (башмак) микроскопа массивный, чаще всего подковообразной формы (у некоторых приборов прямоугольной), что придает устойчивость прибору. Тубусодержатель сделан в форме дуги. Это создает удобство при перестановке микроскопа и его переноске.

К штативу примыкает коробка механизмов, состоящая из системы зубчатых колес, предназначенных для приведения в движение тубуса с помощью макрометрического и микрометрического винтов.

Макрометрический винт (кремальера, макровинт) служит для ориентировочной установки изображения рассматриваемого объекта на фокус.

Микрометрический винт (микровинт) используют для получения четкого изображения рассматриваемого объекта в поле зрения микроскопа. При полном обороте микровинта тубус передвигается на 0,1 мм. На барабане микровинта нанесено 50 делений, каждое из которых соответствует перемещению тубуса на 2 мкм. При вращении винтов по часовой стрелке тубус опускается к препарату, при вращении против часовой стрелки – поднимается от препарата.

Предметный столик (круглый, прямоугольный) предназначен для помещения на нем препарата с исследуемым объектом. Предметный столик подвижен. Его можно перемещать в круговом направлении и во взаимноперпендикулярных плоскостях. В середине столика находится отверстие для прохождения снизу лучей света, отражаемых зеркалом микроскопа. На столике вмонтированы два зажима – пружинящие металлические пластинки, применяемые для закрепления препарата.

На предметный столик в случае необходимости (при подсчете бактерий, при повторном наблюдении определенного участка и т.д.) можно помещать препаратоводитель. На нем имеется система линеек-нониусов, с помощью которых можно закодировать любую точку исследуемого препарата.

Для этого совмещают центр столика и оптическую ось системы микроскопа с центрировочной пластинкой препаратоводителя (в связи с этим предметный столик с препаратоводителем называют крестообразным).

Тубус (труба) является оправой, в верхнюю часть которой вставляется окуляр, а к нижней прикрепляется объективодержатель (револьвер) с гнездами для объективов. Револьвер можно вращать вокруг своей оси, что позволяет оперативно использовать при микроскопии объективы с разной увеличивающей способностью. В микроскопах, у которых тубус расположен под углом к предметному столику, имеется трехгранная призма, направляющая световые лучи в окуляр.

Наиболее важной частью оптического узла микроскопа является объектив (греч. objectum – предмет исследования). Объектив состоит из нескольких линз, заключенных в металлическую оправу. Только одна линза, обращенная к препарату (фронтальная) выполняет функцию увеличения, остальные (их может быть от 3-4 до 10-12) предназначены для коррекции изображения и устранения хроматической и сферической аберрации. Назначение объектива – давать действительное увеличенное и обратное изображение предмета, которое еще увеличивается окуляром.

Классификация объективов проводится по степени исправления оптических искажений – хроматических и сферических аберраций. Хроматические аберрации обусловлены тем, что световые волны с разной длиной волны фокусируются в разных точках на оптической оси. В результате изображение оказывается окрашенным. Сферические аберрации связаны с тем, что свет, проходящий через центр объектива, и свет, идущий через его периферийную часть, фокусируется в разных точках на оси. В результате изображение оказывается нечетким. Ахроматические объективы являются наиболее распространенными на данный момент. В них хроматические аберрации подавляются при помощи стеклянных элементов с разной дисперсией, обеспечивающих схождение крайних лучей видимого спектра – синих и красных – в одном фокусе. Небольшая окрашенность изображения остается и видна иногда в виде слабых зеленых полос вокруг объекта. Сферическая аберрация может быть скорректирована только для одного цвета. Во флюоритовых объективах при помощи добавок к стеклу, улучшающих цветовую коррекцию, окрашенность изображения почти полностью устраняется. Апохроматические объективы – это объективы с самой сложной цветовой коррекцией. В них не только почти полностью устранены хроматические аберрации, но и коррекция сферических аберраций выполнена не для одного, а для двух цветов. Увеличение апохроматов для синего цвета несколько больше, чем для красного, и поэтому для них нужны специальные «компенсирующие» окуляры. Большинство объективов являются «сухими», т.е. они рассчитаны на работу в таких условиях, когда промежуток между объективом и образцом заполнен воздухом; величина NA для таких объективов не превышает 0,95. Если между объективом и образцом ввести жидкость (масло или, что бывает реже, воду), то получится «иммерсионный» объектив с величиной NA, достигающей 1,4, и с соответствующим улучшением разрешения. В настоящее время промышленность выпускает и различного рода специальные объективы. К ним относятся объективы с плоским полем для микрофотографирования, объективы без внутренних напряжений (релаксированные) для работы в поляризованном свете и объективы для исследования непрозрачных металлургических образцов, освещаемых сверху. Конденсор формирует световой конус, направляемый на образец. Обычно в микроскопе предусматривается ирисовая диафрагма для согласования апертуры светового конуса с апертурой объектива, чем обеспечиваются максимальное разрешение и максимальный контраст изображения. (Контраст в микроскопии имеет столь же важное значение, как и в телевизионной технике.) Самый простой конденсор, вполне подходящий для большинства микроскопов общего назначения, – это двухлинзовый конденсор Аббе. Для объективов с большей апертурой, особенно иммерсионных масляных, нужны более сложные конденсоры с коррекцией.

Масляные объективы с максимальной апертурой требуют специального конденсора, имеющего иммерсионный масляный контакт с нижней поверхностью предметного стекла, на котором лежит образец.

Объективы бывают сухие и иммерсионные. Сухим называют объектив, при работе с которым между фронтальной линзой и препаратом находится воздух, а в иммерсионных – жидкость, коэффициент преломления световых лучей которой близок к показателю преломления стекла. При применении иммерсионных объективов лучи света проходят через оптически однородную среду и не меняют своего направления.

Иммерсионные объективы в отличие от сухих на оправе имеют черную круговую нарезку и обозначения:

I - immersion (иммерсия);

HI - homogen immersion (однородная иммерсия);

МИ – масляная иммерсия;

ВИ – водная иммерсия.

Иммерсионные объективы имеют пружинную оправу, что исключает повреждение фронтальной линзы и препарата при их соприкосновении.

Рис. 10. Объективы современного микроскопа Объективы различают по увеличению, которое наносят на их оправу (х8, х20, х40, х90, х100). Каждый объектив характеризуется величиной рабочего расстояния, под которым понимают расстояние в мм от плоскости фронтальной линзы до изучаемого объекта при нахождении его в фокусе. Объективы с меньшим увеличением имеют большое рабочее расстояние и, наоборот, с большим увеличением – меньшее рабочее расстояние. Например, объективы с увеличением х9, х40 имеют соответственно рабочее расстояние 13,8 и 0, мм, а объектив х90, х100 – 0,12 мм. В современных микроскопах установлены объективы с увеличением х100. Иммерсионный объектив имеет рабочее расстояние 0,12 мм, в связи с чем его называют «близоруким». Объективы с малым увеличением имеют большие рабочие расстояния и широкие поля зрения. Поэтому исследования препаратов рекомендуют начинать с небольшого увеличения.

На оправе объективов указана толщина применяемых при микроскопии покровных стекол – 0,17 мм. В случае, если покровные стекла толще или тоньше указанной цифры, следует пользоваться объективом, исправляющим сферическую аберрацию, вызываемую покровным стеклом.

Важная характеристика объектива – его разрешающая способность, т.е.

наименьшее расстояние между двумя точками, в котором просматриваются какие-либо детали. Проще говоря, физический смысл разрешающей способности объектива заключается в возможности с помощью его хорошо различать наименьшие детали объекта.

Разрешающая способность объектива зависит от его числовой апертуры и длины волны света, при которой проводят микроскопию.

Числовая (численная, или нумерическая) апертура объектива характеризует светособирательную способность его, т.е. количество света, попадающего в линзу.

При работе со световыми микроскопами длина волны (l) постоянна, т.к.

объекты исследуют при обычном свете (l=0,55 мкм). Числовую апертуру (А) определяют по формуле:

n – показатель преломления светового луча, проходящего через предметное стекло в среду между фронтальной линзой объектива и стеклом;

sin - половинный угол входного отверстия объектива, т.е. угол, одна сторона которого совпадает с оптической осью, другая – образована линией, соединяющей точку выхода эффективных лучей из объекта с границей действующего отверстия объектива.

Из формулы вытекает следующее. Важно, чтобы величина n была максимальной. На практике этого достигают использованием иммерсионных объективов с применением кедрового масла или его заменителей. Не менее значимой является величина sin /2, т.к. чем больше эта величина, тем выше разрешающая способность объектива. Предел повышения упомянутой величины зависит от степени кривизны фронтальной линзы и числовой апертуры конденсора.

Высокоапертурные объективы необходимо применять с высокоапертурным конденсором. Если апертура конденсора меньше апертуры объектива, то возможности его оказываются не полностью использованными.

Необходимо знать, что повысить величину sin a/ 2 при использовании иммерсионных объективов можно максимальным поднятием конденсора к предметному столику.

Окуляр (от греч. oculus – глаз) состоит из двух линз – окулярной (верхней) и полевой или собирательной (нижней), заключенных в металлическую оправу. Окуляр собирает лучи, идущие от объектива, и увеличивает изображение, даваемое им. На окулярах указывают их увеличение (х5, х7, х10, х15).

Короткие окуляры дают более сильное увеличение, длинные – слабое.

Рис.11. Бинокулярная насадка к микроскопу Микромед 2, вариант 2- При постоянной и длительной работе с микроскопом следует пользоваться двойными окулярами – бинокулярной насадкой. Насадки могут иметь собственное увеличение (около х15), а их корпуса раздвигаются в пределах 55-75 мм, что создает удобство и возможность наблюдателю производить микроскопию обоими глазами. Работа с бинокулярной насадкой улучшает видимость объекта и снижает утомляемость зрения. В настоящее время промышленность выпускает бинокулярные микроскопы (Биолам С-3, Биолам РКонденсор применяется для концентрации расходящихся или параллельных лучей, т.е. для освещенности рассматриваемого объекта. Конденсор состоит из конической металлической оправы, в которой укреплены, обычно одна за другой, две чечевицы: снизу двояковыпуклая, а над нею, меньших размеров, плоско-выпуклая. Плоская поверхность меньшей чечевицы должна быть параллельна верхней поверхности предметного столика микроскопа.

Чтобы получить отчетливое изображение, рассматриваемый объект должен находиться в фокусе конденсора, для чего последний приходится регулировать путем опускания или поднятия его, в зависимости от источника света и толщины предметного стекла. Многие микроскопы снабжены «откидным»

конденсором, который при необходимости может быть легко и просто отведен в сторону.

Линзам объективов присущи дефекты сферической и хроматической аберрации. Причина сферической аберрации связана со свойством линз неравномерно преломлять лучи света. Периферические лучи преломляются в большей степени, чем центральные, поэтому рассматриваемый объект приобретает вид расплывчатого пятна.

Явление хроматической аберрации возникает вследствие разложения белого света при прохождении через линзу объектива на сине-фиолетовые и красные лучи.

Этим объясняется появление окраски (радужности) у бесцветного объекта.

Для устранения дефектов сферической и хроматической аберрации применяют коррекционные (исправляющие) объективы: хроматы, апохроматы, планохроматы.

Ахроматы устраняют дефекты сферической и частично хроматической аберрации.

Апохроматы устраняют окрашивание объекта и позволяют получить одинаково резкое изображение от лучей разного цвета.

Планохроматы – разновидность апохроматов с плоским полем зрения.

Эти объективы устраняют искривление поля зрения, которое определяет неравномерность фокусировки объекта, а также используются при микрофотографировании.

Современный микроскоп – это точный оптический прибор, требующий строгого соблюдения ряда правил при работе с ним. Они касаются обращения с прибором и ухода за ним, а также применения правильного освещения, выбора в каждом конкретном случае наилучшего варианта оптической системы (окуляр – объектив – конденсор) и т.п.

Микроскоп устанавливают в хорошо освещенном месте, избегая при этом прямого попадания солнечных лучей на прибор. Работа на столе с темной поверхностью способствует меньшему утомлению глаз.

Микроскоп должен занимать устойчивое положение и располагаться так, чтобы локти рук работающего с ним находились на столе, а кисти могли свободно выполнять необходимые манипуляции, связанные с микроскопией объекта. Микроскопию проводят сидя. Лучше всего использовать винтовой стул, высоту которого можно регулировать и выбирать удобное для работы положение.

При работе с монокулярным микроскопом рекомендуется смотреть в окуляр левым глазом, не закрывая правого, делая необходимые зарисовки, заметки и т.д. В случае использования бинокулярной насадки или бинокулярного микроскопа вначале регулируют расстояние между окулярами в соответствии с расстоянием между глазами наблюдателя так, чтобы поля зрения обоих окуляров слились в одно.

Переносить микроскоп необходимо двумя руками: одной держать штатив, другой – основание микроскопа.

Прибор следует предохранять от толчков, тем более от ударов, соприкосновения с кислотами, щелочами и другими сильнодействующими веществами. Нельзя вынимать окуляр из тубусодержателя во избежание загрязнения пылью последнего и объектива.

В процессе работы желательно защищать микроскоп от дыхания, т.к.

конденсация паров ведет к его порче.

Освещение при микроскопии играет весьма существенную роль. Неправильное или недостаточное освещение не позволяет качественно произвести микроскопию и использовать полностью возможности микроскопа.

При дневном свете и при микрофотосъемках пользуются плоской поверхностью зеркала, при искусственном освещении и слабом дневном – вогнутой.

При работе с конденсором Аббе независимо от источника света нужно пользоваться только плоским зеркалом.

Считают, что хорошее освещение достигается при установке света по методу Кёлера, который осуществляют следующим образом.

1. Стандартный осветитель (ОИ-7, ОИ-19 и др.) располагают на расстоянии 25-30 см от микроскопа.

2. На предметный столик помещают препарат, в рабочее положение переводят объектив х8.

3. Конденсор поднимают до упора, полностью открывают ирисовую диафрагму, зеркало устанавливают плоской поверхностью.

4. Препарат в поле зрения микроскопа фокусируют при открытых диафрагмах осветителя и конденсора.

5. Полевую диафрагму осветителя закрывают. К зеркалу микроскопа подносят белый лист бумаги и ищут резкое изображение спирали осветителя на бумаге.

6. Смотрят в окуляр, передвигая зеркало, находят свет, фокусируют препарат, опускают конденсор до тех пор, пока изображение краев полевой диафрагмы осветителя в плоскости препарата не станет 7. Постепенно открывают полевую диафрагму осветителя так, чтобы освещенный круг ее заполнил все поле зрения микроскопа.

Далее никаких изменений в положении осветителя, зеркала, конденсора микроскопа проводить не следует.

Установку света по Кёлеру рекомендуют при обычной микроскопии, фазово-контрастной и темнополевой.

Устанавливать освещение можно упрощенным способом. Для этого конденсор поднимают до уровня предметного столика, диафрагму полностью открывают, устанавливают объектив с малым увеличением (х8, х10) и, глядя в окуляр, с помощью зеркала добиваются максимального освещения поля зрения. После этого на предметный столик помещают препарат, затем револьвер переводят на объектив х40 и с помощью макровинта находят изображение, четкость которого регулируют очень мелкими поворотами микровинта.

При работе с иммерсионным объективом необходимо выполнить следующие манипуляции.

1. Установить микроскоп на малое увеличение (х8).

2. Установить зеркало плоской стороной и поднять конденсор.

3. Добиться максимального освещения поля зрения полным открытием диафрагмы и установкой зеркала под определенным углом.

4. Поместить препарат на предметный столик, укрепить зажимами, с помощью макро- и микровинтов найти изображение объекта под малым увеличением.

5. Перевести револьвер в нейтральное положение, нанести каплю иммерсионной жидкости на препарат, не размазывая ее.

6. Установить микроскоп на большое увеличение (х90) поворотом револьвера и под контролем глаз опустить объектив до соприкосновения с иммерсионной жидкостью, за погружением фронтальной линзы в жидкость следует наблюдать сбоку.

7. Провести ориентировочную установку на фокус макрометрическим винтом, а микровинтом установить более четкое изображение объекта.

8. Промикроскопировать объект, по окончании чего поднять макровинтом тубус, убрать микропрепарат.

9. С помощью револьвера объектив отвести в сторону и протереть фланелевой салфеткой от иммерсионной жидкости.

10. Предметный столик покрыть марлевой салфеткой, револьвер поставить в нейтральное положение или установить микроскоп на малое увеличение и опустить тубус вниз.

МАСЛО ВОЗДУХ

СТЕКЛО

Хранить микроскоп нужно закрытым от пыли под специальным чехлом или стеклянным колпаком. Следует периодически проверять чистоту и состояние оптики и протирать ее, но только снаружи. Для чистки применять волосяную кисточку, мягкую ткань, но не марлю и вату, оставляющие волокна и нити на линзах прибора. Кисточку или ткань можно смочить водой или спиртом. Нельзя применять бензин или ксилол, т.к. их воздействие может привести к расклеиванию линз. Этими веществами можно протирать механические трущиеся части микроскопа,а затем смазывать их маслом.

Один раз в год микроскоп должен посмотреть квалифицированный специалист-оптик и при необходимости отремонтировать его.

Исследователь не должен ремонтировать линзы объективов или сложные механизмы с точной настройкой. Никогда не следует разбирать объектив, чтобы почистить составляющие его линзы, т.к. расстояние между линзами играет существенную роль. Лучше предоставить делать это специалистам.

Пыль на окуляре может давать темные пятна, которые выявляют при вращении его по кругу. Если при очистке наружных поверхностей верхней и нижней линз пятна не исчезают, необходимо вывинтить линзы из оправы и очистить их. Окуляры устроены относительно просто и не обязательно привлекать к этой работе техника-оптика.

Необходимо помнить, что касаться пальцами оптических поверхностей нельзя. Чистые линзы обеспечивают качественное изображение объекта.

Иммерсия (от лат. immersio - погружение) - жидкость, заполняющая пространство между объектом наблюдения и специальным иммерсионным объективом (конденсором и предметным стеклом). В основном применяются три типа иммерсионных жидкостей: масляная иммерсия (МИ/Oil), водная иммерсия (ВИ/W) и глицериновая иммерсия (ГИ/Glyc), причем последняя в основном применяется в ультрафиолетовой микроскопии.

Показатель преломления иммерсии близок к показателю преломления стекла фронтального компонента объектива:

Иммерсии Показатель преломления физиологический раствор 1, вода дистиллированная 1, Основные параметры иммерсионного масла стандартизованы:

по ГОСТ 13739-78 «Иммерсионное масло»: показатель преломления nd = 1,515±0,001. Коэффициент пропускания в слое толщиной 10 мм в спектральном диапазоне: 500—720 нм — 95%, 400—480 нм — 92%;

по международному стандарту ИСО «Иммерсионное масло»: показатель преломления пе=1,518 + 0,0005. Коэффициент пропускания в слое толщиной 10 мм в спектральном диапазоне: 500—760 нм — 95%, 400 нм — 60%;

по международному стандарту ИСО «Иммерсионное масло для люминесценции»: коэффициент пропускания в слое толщиной 10 мм в спектральном диапазоне: 500—700 нм — 95%, 365—400 нм — 60%.

Иммерсия применяется в тех случаях, когда требуется повысить разрешающую способность микроскопа или ее применения требует технологический процесс микроскопирования. При этом происходит:

повышение видимости за счет увеличения разности показателя преломления среды и объекта;

увеличение глубины просматриваемого слоя, который зависит от показателя преломления среды.

Кроме того, иммерсионная жидкость может уменьшать количество рассеянного света за счет исчезновения бликов от объекта. При этом устраняются неизбежные потери света при его попадании в объектив.

Иммерсионные жидкости предназначены для использования с иммерсионными объективами. Их показатель преломления близок к показателю преломления стекла, что обеспечивает между препаратом и фронтальной линзой объектива оптически однородную среду и предотвращает рассеивание световых лучей.

Иммерсионные жидкости не должны оказывать кислотного или растворяющего воздействия на линзы или их крепления. В качестве иммерсионных жидкостей используют различные масла, а чаще всего – кедровое масло.

Для микроскопии предпочитают масло с высокой вязкостью, которое почти не стекает и не растекается. Необходимо следить, чтобы в масле не было пузырьков воздуха. Для люминесцентной микроскопии применяют масло не способное флюоресцировать.

На препарат наносят обычно одну каплю масла, которой вполне хватает для проведения успешной микроскопии.

В таблице 1 приведены показатели преломления некоторых соединений.

Коэффициент преломления некоторых соединений При работе с иммерсионным объективом в основном применяют кедровое масло. Его получают из семян виргинского можжевельника Yuniperus virginiana L. или зеравшанской арчи Yniperus seravschana. В настоящее время наряду с кедровым маслом применяют синтетические жидкости, соответствующие по оптическим свойствам кедровому маслу.

9. Неисправности, их причины и способы устранения Перечень неисправностей, их причин и способов устранения приведен в таблице 2.

Причины неисправностей и способы их устранения Неисправность Возможные причины Способы устранения Макровинт пе- Неправильная регулиров- Переместить регулироредвигается тя- ка хода. Загрязнение ме- вочные головки в протижело. ханизма перемещения. воположных направлениях. Почистить и смазать.

Тубус или пред- Не отрегулирована зубча- Отрегулировать передачу Микровинт не Микровинт находится в Револьвер установить на работает в одну крайнем положении. объектив х10, перемесиз сторон. тить микровинт в среднее Расфокусировка Объективы плохо ввинче- Прочно ввинтить объекдаже при незна- ны в гнезда револьвера, к тивы в гнезда, хорошо чительном дви- объективу пристало по- прижать препарат зажижении микро- кровное стекло, или же мами к предметному стовинта. засохло масло, плохо уда- лику, удалить засохшее Неясное пятни- Грязь или смазка на оку- Очистить соответствуюстое изображе- ляре, объективе, покров- щие поверхности.

ние. ном стекле или любой поверхности в системе освещения.

Четко сфокуси- Загрязнение источника Очистить соответствуюрованные пятна света, крышки встроенно- щие поверхности, если их или точки, сме- го осветителя или свето- очистить невозможно Неясное изо- Перед объективом масло Заменить среду, удалить бражение, кото- вместо воздуха, воздух загрязнение, заменить порое невозможно вместо масла, пузырьки кровное стекло, приготохорошо сфоку- воздуха в масле, загрязне- вить препарат на другом сировать. ние фронтальной линзы предметном стекле.

объектива, слишком толстое покровное и предметное стекла.

Поле зрения ос- Объектив не зафиксиро- Способ устранения очевещено не пол- ван в нужном положении, виден.

ностью. конденсор не находится Поле зрения ос- Неправильно расположе- Расположить зеркало под вещено не рав- но зеркало, не отцентри- углом, максимально отномерно. рован конденсор. ражающем лучи света в Через поле зре- Пузырьки воздуха в им- Убрать масло с препарата, ния проплывают мерсионном масле. нанести новое, тщательно Длина волн видимого света лежит в пределах 0,4 - 0,7 мкм. Максимальное разрешение (половина длины волны), которое можно получить при световой микроскопии составляет около 0,2 мкм (200 нм).

10. Микроскопия в темном поле (темнопольная микроскопия) Метод тёмного поля в проходящем свете используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции — т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса, и прошедших через объектив. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления.

У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света.

Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип – препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить (но не «наблюдать» в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов.

При помощи иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате 10-9 м. т. Но форму и точные размеры частиц до нм с помощью таких микроскопов определить невозможно. Их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц, а от апертуры объектива и увеличения микроскопа. Так как подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например, угольная электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии. Непрозрачные препараты (например, шлифы металлов), наблюдаемые по методу тёмного поля в отражённом свете, освещают сверху - через специальную кольцевую систему, расположенную вокруг объектива и называемую эпиконденсором.

Если осветить объект косопадающим светом, то наблюдается явление Тиндаля: мелкие частицы, невидимые глазом, становятся видимыми, так как они сами начинают светиться отраженным светом. Принцип исследования микробов в темном поле зрения заключается в том, что в объектив попадают не прямые лучи света, а отраженные исследуемым объектом, вследствие чего неосвещенное поле остается темным, а микробные тела освещены очень ярко. При темнопольной микроскопии микробы изучают в препарате “раздавленная капля”, используя предметные стекла не толще 1,2 мм, а толщина покровных не должна превышать 0,2 мм.

Рис. 13. Темнопольный конденсор для микроскопов МИКРОМЕД 1, Для наблюдения в темном поле применяют темнопольный конденсор.

Он отличается от обыкновенного тем, что весь центр его передней линзы зачернен и в объектив попадают только косые боковые лучи.

Микроскопия в темном поле позволяет увидеть объекты, величина которых лежит за пределами обычного микроскопа. Например, можно рассмотреть жгутики бактерий, которые имеют толщину 0,01 мкм. Темнопольная микроскопия не позволяет рассмотреть внутреннее строение бактерий, за исключением их крупных форм, типа дрожжей.

Для микроскопии в темном поле можно использовать обычный конденсор Аббе (рис.14), который развинчивают и между его линзами кладут кружок черной фотобумаги с таким расчетом, чтобы периферическая часть фронтальной линзы оставалась свободной.

Рис.14. Конденсор Аббе в составе микроскопа МИКРОМЕД-2, вариант Препараты для исследования в темном поле должны быть приготовлены с использованием очень чистых предметных и покровных стекол.

Между препаратом и конденсором помещают иммерсионное масло – каплю его наносят на верхнюю линзу конденсора. После этого, поднимая и опуская конденсор, добиваются появления в поле зрения светлого пятна, которое с помощью регулировочных винтов конденсора выводят в середину поля зрения. Затем, с помощью нужного увеличения, переходят к наблюдению.

Метод используют с целью исследования живых клеток микроорганизмов.

В практике очень широко применяют темнопольную микроскопию при изучении морфологии лептоспир и учете реакции микроагглютинации (РМА).

10.1. Методы исследования и контрастирования Метод темного поля основан на эффекте, который достигается освещением объекта полым конусом света, внутренняя апертура которого должна превосходить числовую апертуру применяемого объектива. Таким образом, ни один прямой луч не попадает в объектив: при отсутствии объекта поле зрения микроскопа будет темным, а при его наличии - контрастный светлый объект будет виден на темном фоне в отраженном или рассеянном (диффузно отраженном) свете.

Для создания темного поля в биологическом микроскопе применяют:

упрощенный метод, связанный с одновременным диафрагмированием осветительной апертуры конденсора и выходной апертуры объектива, при этом объектив должен иметь ирисовую диафрагму или вкладыш, которые позволяют уменьшать выходное отверстие объектива, приближая его к осветительной апертуре, оптимальной для получения эффекта темного поля;

специальный конденсор темного поля.

Метод исследования в темном поле впервые был предложен австрийскими учеными Р. Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 г.

Метод фазового контраста связан с изменением условий освещения при наблюдении слабоконтрастных биологических объектов (микроорганизмов, растительных клеток) в неокрашенном состоянии с целью их визуализации (контрастирования).

В отличие от метода темного поля, выявляющего лишь контуры объекта, метод фазового контраста позволяет увидеть элементы внутренней структуры рассматриваемого прозрачного объекта. Устройство дает возможность преобразовывать фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, в амплитудные, в результате чего прозрачные микроорганизмы становятся видимыми.

В зависимости от размера фазовых колец и способа их получения различают:



Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ЛЕСОТЕХНИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ имени С.М. Кирова И.А. Маркова, доктор сельскохозяйственных наук, профессор СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ЛЕСОВЫРАЩИВАНИЯ (Лесокультурное производство) Учебное пособие для студентов, магистрантов и аспирантов специальности 250201 – Лесное хозяйство Допущено УМО по образованию в области лесного дела в качестве учебного пособия...»

«Е. В. Логинова, П. С. Лопух ГИДРОЭКОЛОГИЯ Учебное пособие PDF создан в pdfFactory Pro пробной версии www.pdffactory.com Е. В. Логинова, П. С. Лопух ГИДРОЭКОЛОГИЯ Курс лекций МИНСК БГУ 2011 2 PDF создан в pdfFactory Pro пробной версии www.pdffactory.com УДК 502.51(28) ББК 20.18 Р е ц е н з е н т ы: Доктор географических наук, профессор А.А. Волчек; Доктор географических наук, главный научный сотрудник Института природопользования НАН Беларуси Т. И. Кухарчик Логинова, Е.В., Лопух П.С. В 70...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Оренбургский государственный университет Кафедра медико-биологической техники А.Д. СТРЕКАЛОВСКАЯ, Н.В. БАЗАРОВА ВЫПОЛНЕНИЕ И ЗАЩИТА КУРСОВЫХ РАБОТ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Рекомендовано к изданию Редакционно-издательским советом государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования – Оренбургский государственный университет Оренбург 2004 ББК...»

«Министерство здравоохранения и социального развития Иркутский государственный медицинский университет (ГОУ ВПО ИГМУ МИНСОЦЗДРАВ РАЗВИТИЯ РОССИИ) Медико-профилактический факультет Кафедра микробиологии Методические рекомендации к практическим занятиям для студентов ИГМУ по теме: МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Иркутск - 2010 Методические рекомендации составлены: Профессором, д.б.н. Е.В. Симоновой Ассистентом кафедры: Ю.В. Журавлевой Методические рекомендации составлены в соответствии с типовым...»

«ПРИОРИТЕТНЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ПРОЕКТ ОБРАЗОВАНИЕ РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ И.И.ВАСЕНЕВ Е.Н. ПАКИНА СОВРЕМЕННЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ В ОПТИМИЗАЦИИ АГРОЛАНДШАФТОВ И ОРГАНИЗАЦИИ УСТОЙЧИВЫХ АГРОЭКОСИСТЕМ Учебное пособие Москва 2008 Рецензент: профессор, доктор биологических наук Макаров О.А. Инновационная образовательная программа Российского университета дружбы народов Создание комплекса инновационных образовательных программ и формирование инновационной образовательной среды, позволяющих эффективно...»

«Рабочая программа по биологии 5 класс учителя биологии ГБОУ СОШ № 1302 Ройфе Леонида Владленовича На 2013-2014 учебный год 1 2013-2014 учебный год Пояснительная записка Рабочая программа для курса биологии 5 класса разработана на основе нормативных документов: -Закон РФ Об образовании -ФГОС ООО -Фундаментальное ядро содержания общего образования -Примерной программы по биологии Рабочая программа реализуется по УМК Пономарёвой И.Н. - Учебник И.Н. Пономаревой, И.В. Николаева, О.А. Корниловой,...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Государственное образовательное учреждение Оренбургский государственный университет Кафедра геологии В.Б. ЧЕРНЯХОВ ОБЩАЯ ГЕОЛОГИЯ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ПЕРВОЙ УЧЕБНОЙ ГЕОЛОГИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ НА ПОЛИГОНЕ ОРЕНБУРГСКИЙ Рекомендовано к изданию Редакционно-издательским советом Государственного образовательного учреждения Оренбургский государственный университет Оренбург 2002 ББК 26.3 я 7 Ч 49 УДК 551.07 Рецензент кандидат геолого-минералогических наук,...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОУВПО СИБИРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ГЕОДЕЗИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ Л.А. Черновский УЧЕНИЕ О ГИДРОСФЕРЕ Утверждено редакционно-издательским советом академии в качестве учебно-методического пособия для студентов, обучающихся по специальности 020804 Геоэкология Новосибирск СГГА 2010 УДК 556 ББК 26.22 Ч493 Рецензенты: кандидат технических наук, профессор СГГА Б.В. Селезнв кандидат биологических наук, зав. лабораторией ИПА СО РАН Н.П. Миронычева-Токарева...»

«А.М. Ивлев, А.М. Дербенцева, В.Т. Старожилов НАУКИ О ЗЕМЛЕ Курс лекций Владивосток 2006 1 Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию Дальневосточный государственный университет Академия экологии, морской биологии и биотехнологии Кафедра почвоведения и экологии почв Институт окружающей среды Кафедра физической географии А.М. Ивлев, А.М. Дербенцева, В.Т. Старожилов НАУКИ О ЗЕМЛЕ Учебное пособие Владивосток Издательство Дальневосточного университета...»

«Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Рязанский государственный университет имени С.А. Есенина В.А. Марков, Е.С. Иванов, Е.А. Лупанов Биоразнообразие и охрана природы Учебное пособие Рязань 2009 ББК 20.1я73 М26 Печатается по решению учебно-методического совета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Рязанский государственный университет имени С.А. Есенина в соответствии с...»

«Министерство образования Российской Федерации Ярославский государственный университет им П.Г. Демидова В.П. Семерной САНИТАРНАЯ ГИДРОБИОЛОГИЯ Учебное пособие по гидробиологии Издание второе, переработанное и дополненное Ярославль 2002 1 ББК Е 082я73 С 30 УДК 574.5:001.4 Семерной В.П. Санитарная гидробиология: Учеб. пособие по гидробиологии. 2е изд., перераб. и доп. Яросл. гос. ун-т. Ярославль, 2002. 147 с. ISBN 5-8397-0244-7 Данное учебное пособие написано по материалам, собранным автором к...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ГИДРОМЕТЕОРОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Н.Е.СЕРДИТОВА Э К О Н О М И К А П РИ РО Д О П О Л ЬЗО В А Н И Я : Э К О Л О Г О -Э К О Н О М И Ч Е С К И Й А С П Е К Т Рекомендовано УМ по образованию в области природообустройства и О водопользования в качестве учебного пособия для студентов высших учебных...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Федеральное государственное учреждение высшего профессионального образования Мичуринский государственный аграрный университет Кафедра земледелия и мелиорации УТВЕРЖДЕНО протокол № 5 методической комиссии агрономического факультета от 24 декабря 2006 г. Методические указания по выполнению лабораторных и самостоятельных занятий по дисциплине Мелиорация на тему: Расчет размеров пруда и плотины для студентов 4 курса агрономического факультета по...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное бюджетное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского Хомутов А.Е., Крылова Е.В., Копылова С.В. АНГИОЛОГИЯ Учебно-методическое пособие Рекомендовано методической комиссией биологического факультета для студентов биологического факультета по направлениям Биология, Экология и природопользование и факультета физической культуры и...»

«1 МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКАЯ АССОЦИАЦИЯ ТРОМБОЗОВ И ГЕМОРРАГИЙ И ПАТОЛОГИИ СОСУДОВ ИМЕНИ А.А.ШМИДТА-Б.А.КУДРЯШОВА. ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Второе издание Москва-2011 2 Лабораторные методы исследования системы свертывания крови: Методические рекомендации АТГПСС им. А.Шмидта-Б.А.Кудряшова. Второе издание.2011 год. Авторы: Сотрудники Первого Московского медицинского университета...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева КОНЦЕПЦИИ СОВРЕМЕННОГО ЕСТЕСТВОЗНАНИЯ Конспект лекций Учебное пособие для студентов высших учебных заведений Чебоксары 2011 УДК 500 (075.8) ББК 20 я 73-2 К 78 Концепции современного естествознания. Конспект лекций : учебное пособие для студентов высших учебных заведений / сост. Воробьев Д....»

«ГОУ ВПО ТАТАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ГУМАНИТАРНО-ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА БИОЭКОЛОГИИ А.М. Басыйров ВАЛЕОЛОГИЯ Учебное пособие Казань ЗАО Новое знание 2010 УДК 613 (075.8) ББК 51.204.0 я73 Б27 Печатается по решению редакционно-издательского совета Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета Научный редактор: Доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биоэкологии ТГГПУ И.И. Рахимов Рецензенты: Кандидат биологических наук, доцент кафедры ТИМЕГО ТГГПУ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРА РНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра микробиологии, эпизоотологии и вирусологии Государственное управление ветеринарии Краснодарского края Государственное учреждение Краснодарского края Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория А.А. ШЕВЧЕНКО, О. Ю. ЧЕРНЫХ, Л.В. ШЕВЧЕНКО, Г.А. ДЖАИЛИДИ, Д.Ю. ЗЕРКАЛЕВ. А.Р. ЛИТВИНОВА,...»

«МОСКОВСКИЙ ГОРОДСКОЙ ДВОРЕЦ ДЕТСКОГО (ЮНОШЕСКОГО) ТВОРЧЕСТВА ЦЕНТР ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ ИНФОРМАЦИОННО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КАБИНЕТ КАТАЛОГ (со ссылками на электронные сетевые публикации) изданных методических, информационных и научных материалов, разработанных специалистами Центра экологического образования МГДД(Ю)Т (или с их участием) за период с 1990 по 2011 год Составитель каталога – Буянов В.Э., заведующий ИМК ЦЭО МГДД(Ю)Т, телефон: 8 (910) 435-12-39, E-mail: buvl@ya.ru; imk-ceo-mgddjut@ya.ru...»

«Английский язык в сфере промышленного рыболовства : учеб. пособие / сост. : Г.Р. АбдульА 13 манова, О.В. Федорова Астрахан. гос. техн. ун-т. Астрахань Изд-во ; – : АГТУ, 2010. – 152 с. ISBN 978-5-89154-363-8 Предназначено для аудиторной и самостоятельной работы студентов I–III курсов очной, заочной и дистанционной форм обучения, обучающихся по специальности 111001.65 Промышленное рыболовство. Основной целью сборника является овладение навыками чтения текстов профессиональной направленности. В...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.