WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Разработка и применение методов оценки качества дарбэпоэтина альфа в процессе биотехнологического производства

На правах рукописи

ОРЛОВА Наталья Владимировна

Разработка и применение методов оценки качества

дарбэпоэтина альфа в процессе биотехнологического

производства

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2014

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика).

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, Хамитов Равиль Авгатович

Официальные оппоненты:

Ленёва Ирина Анатольевна – доктор биологических наук, ФГБУ «Научноисследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, лаборатория экспериментальной вирусологии, заведующая.

Василенко Иван Александрович – доктор химических наук, профессор, испытательная лаборатория «Олфарм», генеральный директор.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский химикотехнологический университет имени Д. И. Менделеева».

Защита состоится 10 декабря 2014 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, Россия, Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. (495) 377-93-98.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» и на сайте http://mgavm.ru.

Автореферат разослан «» 2014 года.

Ученый секретарь Грязнева Татьяна диссертационного совета, Николаевна профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Создание эффективных и безопасных лекарственных средств с использованием методов генной инженерии на всех этапах фармацевтической разработки обеспечивается проведением аналитического контроля с применением надежных методов исследования. Вопросы контроля качества и стандартизации лекарственных средств особенно актуальны в связи с разработкой более эффективных генно-инженерных средств нового поколения (Дегтерев Е.В., 2002).

Одним из таких средств является дарбэпоэтин – гипергликозилированный аналог человеческого рекомбинантного эритропоэтина, применяемый для коррекции анемий различного генеза (SinclairA.M., 2005). В настоящее время на российском рынке представлен только оригинальный препарат дарбэпоэтина – Аранесп, производства фирмы Amgen, США. Для данного белка отсутствуют единые требования к стандарту качества, а также дарбэпоэтин не имеет доступных стандартных образцов.

Важной задачей в прикладной метрологии в биотехнологическом производстве является разработка стандартных образцов. Кроме того, необходимо систематизировать задачи аналитического контроля по этапам создания лекарственного средства (Дегтерев Е.В., 2002).

Таким образом, мониторинг качества наиболее важных параметров на разных стадиях биотехнологического процесса такого востребованного белка как дарбэпоэтин является актуальной задачей, решение которой позволит получать безопасный и эффективный рекомбинантный продукт.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы является разработка и применение методов оценки качества дарбэпоэтина альфа в процессе биотехнологического производства.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка и характеристика методов аффинной хроматографии и обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при определении концентрации дарбэпоэтина альфа в культуральной жидкости, полупродуктах и продуктах.

2. Разработка методов оценки уровня гликозилирования дарбэпоэтина на различных этапах биотехнологического процесса.

3. Разработка методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса.

3. Валидация методик оценки качества дарбэпоэтина альфа.

4. Стандартизация конечного рекомбинантного продукта в соответствии с выбранными критериями качества.

5. Разработка стандартного образца предприятия дарбэпоэтина альфа.

Научная новизна. Впервые в РФ разработан методологический подход к оценке качества готового биомедицинского продукта и полупродуктов на каждом этапе технологического процесса производства субстанции и готовой лекарственной формы дарбэпоэтина (от получения клона-продуцента до готовой лекарственной формы), включающий применение таких методов как ОФ ВЭЖХ, изоэлектрическое фокусирование с дальнейшим иммуноблоттингом, капиллярный зональный электрофорез (КЗЭ) и установление биологической активности.

Впервые показана целесообразность применения методики ОФ ВЭЖХ для количественного определения дарбэпоэтина альфа на первых стадиях технологического процесса производства, включая культивирование линии клеток продуцента.

Разработаны методики ОФ ВЭЖХ и изоэлектрического фокусирования с последующим иммуноблоттингом, представляющие собой инструмент для контроля качества при идентификации дарбэпоэтина на фоне сложных смесей балластных веществ.

Разработан и охарактеризован по наиболее важным параметрам (молекулярный вес белка, концентрация белка, степень гликозилирования, специфическая активность и т.д.) стандартный образец предприятия дарбэпоэтина, позволяющий осуществлять метрологическое обеспечение контроля качества биотехнологического процесса.

Научная новизна работы подтверждена патентом России № 2523948.

Практическая значимость. Разработанные методики представляют собой готовый инструмент для обеспечения оценки качества на фармацевтическом производстве, проведения исследований в медицинских учреждениях, осуществления допингконтроля, а также фундаментальных и прикладных научно-исследовательских работ.

Новые методики, разработанные для установления критических параметров дарбэпоэтина, были внесены в проект фармакопейной статьи предприятия на субстанцию и готовую лекарственную форму, а также опытно-промышленный регламент на субстанцию (№ 56882590-17-12) и на готовую лекарственную форму (№ 56882590ООО «Фармапарк».

Работа выполнена в рамках государственного контракта Министерства образования и науки РФ № 16.522.12.2008 в 2011-2013 гг. на базе отдела медицинской биотехнологии ФГУП «ГосНИИгенетика».

Личный вклад соискателя. Разработка методик оценки качества дарбэпоэтина на каждом технологическом этапе производственного процесса получения биофармацевтического продукта, проводилась совместно с к.б.н. Мосиной А.Г., к.б.н. Стародубцевой Л.И., а также с лабораторий иммунологии ФГУП ГосНИИгенетика под руководством к.б.н. Юрина В.Л., за что им выражается глубокая благодарность. Автором проведены обоснование методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина, валидация разработанных методик, разработка спецификации на субстанцию и готовую лекарственную форму рекомбинантного дарбэпоэтина, вошедшая в проект фармакопейной статьи предприятия, а также разработка нормативнотехнической документации на стандартный образец предприятия.

ставлены и обсуждены на международном симпозиуме «Биофарма – 2013: от науки к промышленности» (Будва, 2013), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика» и сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2014).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 7 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК (Биотехнология, Биофармацевтический журнал).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на странице машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список использованной литературы включает 99 источников, из них 70 зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 23 таблицы, 38 рисунков и страниц приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Разработанная схема мониторинга качества дарбэпоэтина на всех этапах технологического процесса производства субстанции дарбэпоэтина (включающая изоэлектрическое фокусирование, капиллярный зональный электрофорез, ОФ ВЭЖХ и определение биологической активности) обеспечивает получение продукта надлежащего качества.

2. Обоснованные параметры стандартизации дарбэпоэтина (степень гликозилирования, концентрация и биологическая активность) позволяют специфицировать его в соответствии с международными требованиями к биофармацевтическим генноинженерным продуктам.

3. Установленные критерии валидации (специфичность, линейность, правильность, прецизионность, предел количественного определения, диапазон применения, робастность) аналитических методик оценки качества образцов дарбэпоэтина обеспечивают надлежащий производственный контроль на всех этапах технологического процесса производства лекарственного средства.

4. Обоснованные показатели качества стандартного образца дарбэпоэтина, включающие подтверждение подлинности с помощью капиллярного электрофореза, изоэлектрического фокусирования с иммуноблоттингом, масс-спектрометрии, установление биологической активности in vivo, а также определения степени сиалирования, позволяют использовать его для подтверждения соответствия производственных серий субстанции дарбэпоэтина установленным требованиям.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в рамках государственного контракта Министерства образования и науки РФ № 16.522.12.2008 «Разработка технологии получения гипергликозилированного белка для стимулирования эритропоэза - дарбэпоэтина альфа». Основная часть работ выполнена в период с 2011 по 2013 гг. на базе отдела медицинской биотехнологии Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Используемые линия клеток продуцента, полупродукты и продукты. Линия продуцента дарбэпоэтина альфа была получена сотрудниками отдела медицинской биотехнологии ГосНИИгенетика путем трансформации клеток яичника китайского хомяка СНО-S экспрессионной плазмидой рCI-dEPO2x, содержащей ген целевого белка. Линия продуцента дарбэпоэтина представляет собой высокопродуктивный клон трансфецированных экспрессионной плазмидой клеток СНО-S, продуцирующий не менее 50 мкг/мл дарбэпоэтина альфа с высокосиалированными формами белка. Продукты и полупродукты дарбэпоэтина были получены сотрудниками отдела медицинской биотехнологии ГосНИИгенетика в нескольких этапах: концентрирование и диафильтрация культуральной жидкости на мембранах, анионообменная хроматография, катионообменная хроматография, концентрирование конечного продукта, гель-фильтрация.

Методы исследований.

Dionex UltiMate 3000, под управлением программного обеспечения Chromelion 6.80.

В случае аффинной хроматографии разделение проводилось на колонке Tricorn 5/ (GE HealthCare, США) с общим объемом сорбента 300 мкл. При проведении ОФ ВЭЖХ разделение проводилось на обращено-фазовой колонке С4 с размером частиц 5 мкм и размером пор 300 А (YMC, Япония). Подлинность дарбэпоэтина в хроматографических фракциях подтверждалась в электрофорезе с последующей окраской раствором нитрата серебра и иммуноблоттинге со специфичными антителами. Изоформенный состав устанавливали с помощью изоэлектрического фокусирования в геле с использованием оборудования и реагентов фирмы GE Healthcare. Для установления подлинности белков по изоформенному составу с помощью капиллярного электрофореза использовался прибор PA 800 plus (Beckman, США). Количество сиаловых кислот устанавливалось с помощью резорцинового метода, где использовался спектрофотометр фирмы Bio-Rad, США. Для установления биологической активности in vivo был использован гемоанализатор Advia 2000 и программное обеспечение PLA 2.0 (StegmannSystems). Эксперименты проводили на нормоцитемических мышах породы balb/с. Молекулярный вес белка устанавливали методом матричноактивированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI) на приборе Ultraflex TOF/TOF (BrukerDaltonics, Германия). В качестве матрицы использовали 2,5 дигидроксибензойную кислоту (раствор 20 мг/мл в 50% ацетонитриле, содержащем 0,1% ТФУ). Масс-спектрометрический анализ проводили в отражательном режиме регистрации положительно заряженных ионов. В качестве стандартов использовались международный европейский стандарт эритропоэтина - Erythropoietin BRP (EDQM, ЕС) и оригинальный препарат Аранесп (Amgen, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка методики оценки концентрации дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса производства. В качестве базовых методов для разработки использовали методы аффинной и высокоэффективной обращено-фазовой хроматографии.

Метод аффинной хроматографии основан на специфичном взаимодействии молекул целевого белка дарбэпоэтина с лигандами, связанными с инертным носителем.

В качестве лигандов были использованы моноклональные антитела к эритропоэтину, полученные в лаборатории иммунологии ФГУП ГосНИИгенетики, специфичность которых в отношении дарбэпоэтина была установлена при сопоставлении эффективности выделения эритропоэтина и дарбэпоэтина из культуральных жидкостей. Выделение рекомбинантных белков из культуральной жидкости проводили на иммуноаффинном сорбенте, объемом 100 мл. Культуральную жидкость объемом около 1 л, содержащую эритропоэтин или дарбэпоэтин в концентрации от 50 до 100 мкг/мл, нанесли на сорбент. Элюцию целевого белка проводили глициновым буфером с рН 2, после стадии удаления неспецифических примесей. Концентрацию каждого из белков в элюате устанавливали методом УФ-спектрометрии. Полученные в ходе хроматографирования культуральной жидкости, содержащей дарбэпоэтин, фракции были проанализированы в белковом электрофорезе. Результаты, представленные на рис. 1, показывают наличие целевого белка в элюате, и незначительное количество в буферном растворе после элюции дарбэпоэтина с колонки. Полученные данные свидетельствуют о специфичности иммуноаффинного сорбента к дарбэпоэтину.

25 мкл с концентрацией, не превышающей 20 мкг/мл. Перед началом анализа колонку уравновешивали подвижной фазой А (150 мМ NaCl, 10 мМ Na3PO4, рН 7.4), при скорости потока 0,2 мл/мин. Ступенчатую подачу элюентов осуществляли по следующей схеме: 0-7 мин элюент А (150 мМ NaCl, 10 мМ Na3PO4, рН 7.4), 7-12 мин элюент B (3М NaCl, 10 мМ Na3PO4, рН 2.0), 12-17 мин элюент С (2М глицин, рН 2.0).

Скорость потока составляла 0,2 мл/мин. Температура автосамплера составляла 4,0±0,1 С. Элюирующиеся с колонки вещества детектировали с помощью флюориметрического детектора при длине волны поглощения 270 нм и длине волны эмиссии 340 нм с последующей фиксацией результатов и их компьютерной обработкой.

В результате проведения серии аналитических циклов была установлена прямая зависимость между площадью пика, элюируемого дарбэпоэтина, и его концентрацией в нанесенном образце. Были установлены аналитические параметры данной методики (специфичность, линейность, правильность, прецизионность и др.) в диапазоне концентраций 5 -20 мкг/мл.

Таким образом, метод аналитической аффинной хроматографии может использоваться для количественного определения дарбэпоэтина. В то же время малое количество рабочих циклов аффинного сорбента и высокая стоимость моноклональных антител требовало разработки более экономичного метода для рутинной оценки содержания дарбэпоэтина как в культуральной жидкости, так и в хроматографических фракциях на разных стадиях выделения белка.

В качестве альтернативного метода была рассмотрена обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ), принцип которой основан на разделении белковых и органических веществ по степени их полярности. Для разделения образцов, содержащих дарбэпоэтин, методом ОФ ВЭЖХ был использован сорбент С4, характеризующийся слабой гидрофобностью.

Перед началом анализа колонку уравновешивали подвижными фазами А (0,1% трифторуксусной кислоты) и Б (0,1% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле) в соотношении 60%:40%, при скорости потока 1 мл/мин. Схему градиентной подачи элюентов для оптимального разделения дарбэпоэтина и балластных компонентов культуральной жидкости подбирали экспериментальным путем. Режим хроматографирования был выбран по следующим параметрам: время удерживания дарбэпоэтина не более трех объемов колонки (не более 14 мин), фактор асимметрии пика 0,8 – 1,4, эффективность разделения не менее 600 теоретических тарелок. Градиентную подачу элюентов осуществляли по следующей схеме: за первые 15 минут подача элюентов меняется линейно до соотношения 40% (подвижной фазы А): 60% (подвижной фазы Б), затем за следующие 5 минут подача подвижной фазы А линейно сводится к 0%, в таком соотношении осуществляется промывка колонки еще в течении 5 минут, после чего за 2 минуты подача элюентов возвращается к первоначальному соотношению.

Температура автосамплера составляла 4±0,1 С, температура колонки 35±0,1 С. Объем вводимой пробы 25 мкл. Элюирующиеся с колонки вещества детектировали при длине волны 214 нм с последующей фиксацией результатов и их компьютерной обработкой.

В ходе разработки и валидации данной методики были установлены все необходимые параметры качества аналитической методики, которые гарантировали высокую точность получаемых результатов (т.к. относительное стандартное отклонение (RSD) для повторяемости и промежуточной прецизионности менее 2%). Также было установлено, что методика является селективной, правильной (при установлении концентрации степень извлечения лежит в диапазоне 95-105%), линейной в диапазоне нагрузки на колонку по белку 2-3 мкг, предел количественного определения при этом составляет 0,25 мкг.

Полученные данные и параметры аналитического метода ОФ ВЭЖХ были использованы в экспериментах по идентификации целевого белка – дарбэпоэтина в культуральной жидкости. С этой целью разработанным методом анализировали образцы культуральной жидкости и образцы, содержащие коммерческий дарбэпоэтин.

Полученные результаты представлены на рис. 2 и в табл. 1.

Рис. 2. Хроматограммы, полученные для препарата Аранесп с нагрузкой на колонку по дарбэпоэтину 0,5 мкг (А), образца культуральной жидкости дарбэпоэтина (Б), смешанного образца культуральной жидкости и оригинального Введение в образец культуральной жидкости коммерческого дарбэпоэтина с известной концентрацией позволило установить пропорциональную зависимость между концентрацией дарбэпоэтина в образце и площадью основного пика. Степень извлечения в данном случае составляла 101%.

Таблица 1. Результаты установления правильности количественного определения дарбэпоэтина в культуральной жидкости методом ОФ ВЭЖХ При этом было показано, что содержание целевого белка в основном пике культуральной жидкости при электрофоретическом разделении составляет не менее 98%, а дополнительные примесные пики (в левом и правом плечах основного пика) не содержат дарбэпоэтина (рис. 3).

На хроматограммах образцов отрицательного контроля пиков не зафиксировано.

Таким образом, метод ОФ ВЭЖХ позволяет проводить идентификацию (по времени выхода) и количественное определение дарбэпоэтина (по площади пика) в образцах культуральной жидкости, содержащих не менее 10 мкг/мл, что соответствует диапазону концентраций целевого белка как в культуральной жидкости, так и в хроматографических фракциях при его выделении.

Разработка методики оценки степени гликозилирования дарбэпоэтина. На всех этапах оценки продуктивности проводили исследование уровня гликозилирования целевого белка. Для этого использовали два метода: капиллярный зональный электрофорез и изоэлектрическое фокусирование.

Трудности использования капиллярного электрофореза для анализа образцов культуральной жидкости, содержащих дарбэпоэтин, связаны с низкой концентрацией целевого белка в культуральной среде и с невозможностью идентификации пиков изоформ дарбэпоэтина на фоне пиков неспецифических примесей с аналогичной подвижностью. Поэтому для таких образцов требовалось использование другого метода, обладающего достаточной чувствительностью и способного специфично выявлять изоформы дарбэпоэтина. В качестве такого метода нами был использован метод изоэлектрического фокусирования в геле с последующей окраской Кумасси, но при проведении предвалидационных исследований была установлена недостаточная чувствительность методики. В связи с этим методика была модифицирована – после проведения разделения изоформ в геле следовала процедура иммуноблоттинга с применением специфичных к дарбэпоэтину антителами.

Данная методика позволяет определять качественный состав изоформ дарбэпоэтина с различной степенью гликозилирования в диапазонах pI от 2,0 до 10 (рис. 4).

Чувствительность методики составляет около 0,20 мкг.

рассматриваемой методики по параметру специфичность и предел обнаружения. При проведении эксперимента было установлено, что основные изоформы дарбэпоэтина надежно детектируются на фоне компонентов культуральной жидкости, элюирующего буфера и матрикса, что говорит о специфичности данной методики. При этом минимальное количество белка, которое может быть достоверно идентифицировано составляет 0,20 мкг. Данное исследование позволило считать методику валидной.

Разработка методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса. Из первичного пула трансфецированных клеток было получено около 50 стабильных клонов продуцента дарбэпоэтина. Все клоны культивировали в одинаковых условиях в химически определенной, бессывороточной среде производства Lonza, Швейцария.

Разработанный метод ОФ ВЭЖХ позволил провести мониторинг клонов продуцента дарбэпоэтина на ранних этапах культивирования и идентифицировать клоны с максимальной продуктивностью по целевому белку (табл. 2).

Аналитический метод ОФ ВЭЖХ был использован для оценки содержания целевого белка в культуральной жидкости на разных этапах культивирования и во фракциях при поэтапном выделении дарбэпоэтина.

Культивирование линии продуцента проводили в колбах, а затем в волновом биореакторе с объемом 5 л, с использованием коммерческих питательных сред.

В ходе культивирования осуществляли контроль накопления дарбэпоэтина в культуральной среде и степень его гликозилирования. Данные параметры служили основанием для выбора оптимальных условий культивирования линии клеток - продуцента.

Содержание дарбэпоэтина в культуральной жидкости оценивали разработанным методом ОФ ВЭЖХ. Степень гликозилирования дарбэпоэтина на всех этапах культивирования оценивали методом изоэлектрического фокусирования с последующим иммуноблоттингом.

В табл. 2 представлены результаты мониторинга уровня накопления дарбэпоэтина в нескольких процессах культивирования на средах разного состава. Культивирование проводили в колбах с объемом питательной среды 200 мл.

Таблица 2. Результаты анализа образцов культуральной жидкости в ходе проведения оптимизации процесса культивирования Образец культуральной жидкости дарбэпоэтина Время выхода ос- Концентрация дарновного пика, мин бэпоэтина, мг/мл Как видно из представленных в табл. 2 данных, время выхода основного пика во всех образцах культуральной жидкости составляет от 9,44 до 9,59 минут, а концентрация дарбэпоэтина, оцененная методом ОФ ВЭЖХ, увеличивается пропорционально времени культивирования.

Помимо контроля накопления дарбэпоэтина в культуральной жидкости проводили мониторинг качественного состава дарбэпоэтина в тех же образцах культуральной жидкости на самые поздние сутки с помощью изоэлектрического фокусирования образцов культуральной жидкости может быть использована для оценки степени гликозилирования дарбэпоэтина в ходе процесса культивирования. Результаты определения профиля гликозилирования разработанным методом были использованы для корректировки условий культивирования штаммапродуцента путем внесения дополнительных питательных веществ в ходе реакторного глубинного процесса культивирования.

В результате проведения трех различных процессов реакторного культивирования были получены серии культуральной жидкости 340314, 350314 и 360314.

После культивирования следующим технологическим этапом производства субстанции является выделение дарбэпоэтина из культуральной жидкости с использованием различных методов очистки белков. На всех этапах и, в особенности, на этапах концентрирования культуральной жидкости и анионообменной хроматографии, сопровождающейся потерями слабо сиалированных форм дарбэпоэтина, проводили измерение концентрации целевого белка методом ОФ ВЭЖХ.

Результаты, полученные при выделении целевого белка из трех серий культуральной жидкости в ходе первого этапа анионообменной хроматографии, приведены в табл. 3.

Таблица 3. Выход дарбэпоэтина на этапе анионобменной хроматографии Образец, содержащий дарбэпоэин Концентрация дарбэпоэтина, мг/мл Выход, % Серия Объект Как видно из приведенных данных, выход целевого белка после первой стадии анионообменной хроматографии составлял для разных серий культуральной жидкости от 7,4 до 27,5%. Предположительно такая разница по выходу целевого белка была связана с количеством целевых изоформ дарбэпоэтина в разных образцах культуральной жидкости.

Полученные элюаты и культуральные жидкости были проанализированы с помощью изоэлектрического фокусирования с последующим проведением иммуноблоттинга (рис. 6).

Рис.6. Электрофореграммы трех серий культуральной жидкости и элюатов после выделения целевого белка, полученные при изоэлектрическом На приведенных электрофореграммах видно, что образец культуральной жидкости дарбэпоэтина серии 340314 изначально не имел в своем составе наиболее сиалированных форм белка, что подтверждается спектром гликозилирования полученного элюата (рис. 6А), и привело к низкому выходу по целевому белку при анионообменной хроматографии. Две других серии культуральной жидкости (рис. 6Б и 6В) содержали целевой белок со спектром изоформ, соответствующим контрольному белку дарбэпоэтина, и сопоставимые по выходу элюаты высокого качества.

Таким образом, аналитический метод ОФ ВЭЖХ позволяет не только осуществлять контроль эффективности процесса выделения на разных технологических стадиях, но и прогнозировать качество получаемой субстанции дарбэпоэтина.

Стандартизация конечного продукта. На этапе получения фармацевтической субстанции необходимо провести контроль полученной субстанции по основным параметрам.

К контролируемым параметрам относят концентрацию дарбэпоэтина в концентрированном растворе с помощью ОФ ВЭЖХ, которая должна составлять от 2 до мг/мл, а также изоформенный состав белка. Для более точного анализа подлинности белка в фармацевтической субстанции было решено оптимизировать метод капиллярного электрофореза для дарбэпоэтина.

Изначально метод был воспроизведен для эритропоэтина, после чего данные условия анализа было решено применить к новому гликозилированному белку. Но полученные данные продемонстрировали непригодность таких условий для дарбэпоэтина, поскольку методика показала плохую разрешающую способность между пиками, что не позволяло провести обработку полученных данных. Была проделана работа по подбору условий для разделения гликоформ белка, в ходе которой варьировались разные параметры проведения анализа. В результате удалось установить, что наиболее значимое влияние на разделение изоформ в капилляре оказывает значение рН буферного раствора, которое было снижено на одну единицу и таким образом, была получена электрофореграмма образца сравнения, которая демонстрировала хорошее разрешение между пиками изоформ.

Таким образом, наличие соответствующих дарбэпоэтину изоформ в субстанции было установлено с помощью изоэлектрического фокусирования (рис. 7А) и капиллярного электрофореза (рис. 7Б).

Рис. 7. Электрофореграммы субстанции дарбэпоэтина, полученные с помощью А) изоэлектрического фокусирования и Б) капиллярного Данные, полученные с помощью двух методов, продемонстрировали наличие только целевых форм белка. Методом капиллярного электрофореза установлено, что относительное содержание целевых изоформ соответствует разработанной спецификации для данного белка.

На данном этапе также требовалось подтвердить биологическую активность полученной субстанции дарбэпоэтина. Нами был выбран метод определения специфической активности на нормоцитемических мышах, описанный в Европейской Фармакопее для эритропоэтина. Принцип метода заключается в измерении количества ретикулоцитов у мышей после ввода им дозы активного белка.

Предварительно нами были проведены эксперименты по выбору диапазона измерения. В ходе проведения таких экспериментов были подобраны подходящие концентрации белка для ввода доз мышам, которые составляли 0,05, 0,1 и 0,2 мкг/мл. В ходе данного исследования было установлено, что 1 мг дарбэпоэтина в оригинальном препарате обладает специфической активностью около 1 000 000 (1 047 534 ± 115 229) МЕ.

Далее с помощью данного метода удалось установить, что 1 мг дарбэпоэтина в полученной субстанции обладает активностью 1 074 010 ± 128 881 МЕ, что свидетельствует о сопоставимости удельных активностей полученной субстанции и оригинального препарата. Проведение экспериментов по определению биологической активности осуществлялось совместно с сотрудниками лаборатории иммунологии ФГУП ГосНИИгенетика.

Разработанные и оптимизированные методики контроля качества субстанции дарбэпоэтина, а также спецификации на основные параметры гликозилированного белка были внесены в проекты фармакопейной статьи предприятия и опытнопромышленные регламенты.

Разработанные методики и спецификации оценки качества дарбэпоэтина представляют методологический подход оценки качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса получения субстанции дарбэпоэтина.

Создание стандартного образца предприятия. В соответствии с ГОСТ 8. «Стандартные образцы состава и свойств веществ и материалов» была проведена разработка стандартного образца предприятия. С этой целью серию субстанции дарбэпоэтина оценили по перечню нормируемых показателей, включенных в фармакопейную статью предприятия, а также дополнительных методов, обосновывающих пригодность ее в качестве стандарта предприятия.

Подлинность дарбэпоэтина относительно образца сравнения - коммерческого препарата Аранесп дополнительно устанавливали методом времяпролетной массспектрометрии (MALDI). Средняя молекулярная масса дарбэпоэтина (без учета гетерогенности белка) в образце сравнения и субстанции была идентична и составляла 39 ± 5кДа. Исследования проведены сотрудниками ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А.

Овчинникова.

Степень сиалирования белка в стандартном образце подтверждали путем количественного определения сиаловых кислот резорциновым методом. Данный анализ был проведен по стандартной методике, рекомендованной в Европейской Фармакопее для эритропоэтина. Минимальное количество молей сиаловых кислот, приходящихся на 1 моль дарбэпоэтина, было установлено из учета минимальной молекулярной массы коммерческого дарбэпоэтина (34 кДа) и составило 18 моль.

Количество молей сиаловых кислот, приходящихся на 1 моль дарбэпоэтина в стандартном образце предприятия и в оригинальном препарате, составило 21.

Полученные данные демонстрируют соответствие полученной субстанции дарбэпоэтина установленной спецификации, а также идентичность оригинальному препарату, в результате чего данная субстанция дарбэпоэтина была аттестована в качестве стандартного образца предприятия.

Изучение стабильности стандартного образца показало, что в течение 12 месяцев хранения при температуре -20 °С его показатели качества соответствуют специфицированным требованиям.

ВЫВОДЫ

1. Разработанная методика ОФ ВЭЖХ, которая по своей специфичности, чувствительности (предел количественного определения составляет 0,25 мкг) и точности (RSD не превышает 2%) является универсальной для количественного определения дарбэпоэтина в различных смесях, в том числе и таких сложных как культуральная жидкость.

2. Применение изоэлектрического фокусирования на первых стадиях технологического процесса производства биофармацевтической субстанции (стадия отбора клона-продуцента, оценка качества культуральной жидкости) позволяет достоверно идентифицировать наличие целевых изоформ по значению их pI в образцах на фоне примесных компонентов в концентрациях, многократно превышающих концентрацию дарбэпоэтина, что способствует отбору высокопродуктивной линии продуцента дарбэпоэтина.

3. Установленные критерии качества для каждого этапа производственного процесса получения биомедицинского препарата на основе генно-инженерного белка дарбэпоэтина представляют собой концентрацию белка, наличие целевых форм и биологическую активность дарбэпоэтина.

4. Валидация разработанных методик по основным аналитическим характеристикам показала, что методика определения подлинности белка с помощью изоэлектрического фокусирования является специфичной с пределом обнаружения 0,20 мкг, а методика количественного определения дарбэпоэтина является специфичной, линейной в диапазоне нагрузки белка на колонку 2 – 3 мкг, прецизионной (т.к. RSD для повторяемости и промежуточной прецизионности составляет менее 2%), правильной (степень извлечения лежит в диапазоне 95-105%), устойчивой к малым внешним изменениям, при этом предел количественного определения равен 0,25 мкг.

5. Разработанный стандартный образец предприятия был аттестован по специфицированным показателям качества с применением как основных методов – изоэлектрического фокусирования, капиллярного электрофореза, установления биологической активности in vivo, так и с помощью дополнительных методов – времяпролетной масс-спектрометрии, который подтвердил молекулярную массу белка – 39±5 кДа, а также с помощью резорцинового метода было установлено, что на 1 моль дарбэпоэтина приходится 21 моль сиаловых кислот, что соответствует разработанной спецификации.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Разработанные и оптимизированные методики оценки качества, а также спецификации были внесены в проект фармакопейной статьи предприятия на субстанцию и готовую лекарственную форму дарбэпоэтина.

2. Данные, полученные в ходе исследований, включены в опытно-промышленные регламенты на производство субстанции и готовой лекарственной формы рекомбинантного дарбэпоэтина альфа (№56882590-17-12 и № 56882590-18-13 соответственно).

3. По результатам работы был получен патент на изобретение «Эукариотическая клетка-хозяин экспрессии дарбэпоэтина, вектор экспрессии и способ получения дарбэпоэтина альфа» (№ 2523948).

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Препарат, созданный на основе субстанции рекомбинантного дарбэпоэтина альфа, прошедший контроль по разработанной методологии, является первым отечественным препаратом данного белка, используемым для лечения анемий различного происхождения. Полученный препарат дарбэпоэтина альфа не уступает по качеству оригинальному препарату, обладая при этом гораздо меньшей стоимостью, и рекомендуется для широкого применения в медицинской практике.

2. Разработанная методология оценки качества субстанции и полупродуктов на разных стадиях технологического процесса отвечает всем современным как национальным, так и международным требованиям, предъявляемым к медицинским препаратам на основе рекомбинантных белков. Данная методология рекомендуется к внедрению в серийное производство биофармацевтических препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оптимизация технологии культивирования клеток CHO, экспрессирующих рекомбинантный дарбэпоэтин-альфа, в замкнутом объеме с подпиткой /Нурбаков А.А., Лобанова Н.В., Савинова И.Н., Шукуров Р.Р., Орлова Н.В. и др.// Биотехнология. – 2012. - Т. 5 - С. 55-65.

2. Создание стабильной клеточной линии-продуцента рекомбинантного дарбэпоэтина-альфа на основе клеток СНО / Шукуров Р.Р., Лобанова Н.В., Савинова И.Н., Воробьева И.Г., Нурбаков А.А., Ермолина Л.В., Орлова Н.В. и др.// Биотехнология.– 2013. - №2. - С. 46-54.

3. Изучение влияния различных добавок в питательную среду на уровень продукции и степень гликозилирования рекомбинантного эритропоэтина человека, секретируемого производственной клеточной линией CHO-Epo-2 / Орлова Н.В., Антонова Л.П., Лобанова Н.В. и др.// Биотехнология – 2013. - №4 - С. 48-55.

4. Орлова Н.В. Разработка методики количественного определения рекомбинантного эритропоэз-стимулирующего белка эритропоэтина и его аналога дарбэпоэтина с помощью аффинной хроматографии / Орлова Н.В., Хамитов Р.А., Сауткина Е.Н.// Тезисы IV Международного симпозиума «Биофарма 2013:от науки к промышленности».- М.: Фолиум.- 2013.- С.26-27.

5. Орлова Н.В. Валидация методики количественного определения эритропоэтина и дарбэпоэтина в культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии / Орлова Н.В., Хамитов Р.А. // Биофармацевтический журнал. – 2013. - Т. 5 -С. 64-69.

6. Эукариотичесская клетка-хозяин экспрессии дарбэпоэтина, вектор экспрессии и способ получения дарбэпоэтина альфа / Серегин Ю.А., Шукуров Р.Р., Кряжевских И.С., Хамитов Р.А., Сауткина Е.Н., Орлова Н.В. // Патент России № 2325948. – 2014.

– Бюл. № 21.





Похожие работы:

«ПАНОВ АЛЕКСЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ РЕАКЦИЯ ГИДРОКСИЭТИЛИРОВАНИЯ КАК МЕТОД ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ КРАХМАЛА Специальность 02.00.06 – высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2009 www.sp-department.ru Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете имени Д.И. Менделеева в УНЦ Биоматериалы Научный консультант : доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович Официальные оппоненты :...»

«ЛОБАНОВА НАДЕЖДА АЛЕКСАНДРОВНА СИНТЕЗ ПОЛИМЕРНЫХ СУСПЕНЗИЙ С УЗКИМ РАСПРЕДЕЛЕНИЕМ ЧАСТИЦ ПО РАЗМЕРАМ В ПРИСУТСТВИИ ПОЛИМЕРОВ РАЗНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ В КАЧЕСТВЕ СТАБИЛИЗАТОРОВ Специальности: 02.00.06 высокомолекулярные соединения 02.00.11 коллоидная химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА 2012 www.sp-department.ru Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В....»

«Рослова Мария Владимировна СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА СВЕРХПРОВОДНИКОВ НА ОСНОВЕ АРСЕНИДОВ И СЕЛЕНИДОВ ЖЕЛЕЗА С ЩЕЛОЧНЫМИ МЕТАЛЛАМИ 02.00.21 – химия твердого тела АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2014 Работа выполнена на кафедре неорганической химии Химического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова Научный руководитель : Морозов Игорь Викторович доктор химических наук, ведущий научный сотрудник,...»

«Белоусов Петр Евгеньевич ГЕОЛОГИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ, МИНЕРАЛЬНЫЙ СОСТАВ И ГЕНЕЗИС ТИХМЕНЕВСКОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ БЕНТОНИТА (О-В САХАЛИН). Специальность 25.00.11 – Геология, поиски и разведка твердых полезных ископаемых; минерагения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата геолого-минералогических наук Москва - 2013 Работа выполнена в лаборатории геологии рудных месторождений (группа неметаллических полезных ископаемых) института геологии рудных месторождений,...»

«Бикчентаева Рамзия Рифовна НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ДИСЦИПЛИНЫ МАТЕРИАЛОВЕДЕНИЕ (на примере колледжа нефтехимического профиля) 13.00.02 - теория и методика преподавания общепрофессиональных дисциплин АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Казань - 2002 Работа выполнена в лаборатории специальной и практической подготовки Института среднего профессионального образования РАО. Научный руководитель : кандидат...»

«Тимашова Елена Алексеевна Научные основы технологии сопряженного каталитического синтеза циклогексанкарбоновой кислоты гидрокарбоксилированием циклогексена Специальность 05.17.04 – Технология органических веществ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2008 г. 1 Работа выполнена на кафедре Общей Химической Технологии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московская государственная...»

«ПОПОВ ВИКТОР ВЛАДИМИРОВИЧ ОБРАЗОВАНИЕ И ЭВОЛЮЦИЯ ОКСИДНЫХ НАНОСИСТЕМ, ПОЛУЧЕННЫХ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ ПОЛИКОНДЕНСАЦИЕЙ Специальность 02.00.01 – неорганическая химия Специальность 02.00.11 – коллоидная химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Москва - 2011 www.sp-department.ru Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Национальный исследовательский ядерный...»

«Козинец Екатерина Михайловна ДИЕНОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ РОДИЯ И ИРИДИЯ С ДИФЕНИЛФОСФИНФЕРРОЦЕНИЛТИОЭФИРНЫМИ ЛИГАНДАМИ: СИНТЕЗ, АКТИВАЦИЯ, КАТАЛИТИЧЕСКОЕ ГИДРИРОВАНИЕ 02.00.08 – Химия элементоорганических соединений 02.00.04 – Физическая химия автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва Работа выполнена в...»

«Зайцева Юлия Николаевна ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОНТРОЛЯ ЭЛЕКТРОЛИТА АЛЮМИНИЕВОГО ПРОИЗВОДСТВА Специальность 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Красноярск – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химии и химической технологии Сибирского отделения РАН Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Кирик Сергей Дмитриевич Официальные оппоненты : доктор химических...»

«ПЕТРОВ СЕРГЕЙ МИХАЙЛОВИЧ МОДИФИКАТОРЫ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ОКИСЛЕННЫХ ДОРОЖНЫХ БИТУМОВ С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ 02.00.13 – Нефтехимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Казань – 2009 Работа выполнена в Казанском государственном технологическом университете Научный руководитель : доктор технических наук, профессор Кемалов Алим Фейзрахманович Официальные оппоненты : доктор технических наук, профессор Хакимуллин...»

«Сидорова Ирина Тимофеевна Строительство предприятий химической промышленности в СССР на этапе индустриализации 1928 - 1939 гг. (на примере Березниковского химического комбината) Специальность 07.00.02 – Отечественная история Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата исторических наук Ижевск – 2011 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пермский государственный технический университет доктор...»

«ПЕТУХОВ ДМИТРИЙ ИГОРЕВИЧ ВЛИЯНИЕ МИКРОСТРУКТУРЫ НА ПРОЦЕССЫ МАССОПЕРЕНОСА В МЕМБРАНАХ АНОДНОГО ОКСИДА АЛЮМИНИЯ Специальность 02.00.21 – Химия твердого тела 05.17.18 – Мембраны и мембранная технология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва-2013 Работа выполнена на кафедре наноматериалов Факультета наук о материалах и в лаборатории неорганического материаловедения кафедры неорганической химии Химического факультета федерального...»

«БРЮЗГИН Евгений Викторович СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИВИТЫХ ПОЛИМЕРНЫХ СЛОЕВ НА ПОВЕРХНОСТИ АЛЮМИНИЯ Специальность 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Волгоград – 2010 Работа выполнена на кафедре Технология высокомолекулярных и волокнистых материалов Волгоградского государственного технического университета. Научный руководитель доктор химических наук, профессор Навроцкий Александр Валентинович....»

«БАЮКИН Михаил Валерьевич ИНФОРМАЦИОННАЯ СИСТЕМА ПОДДЕРЖКИ ПРИНЯТИЯ РЕШЕНИЙ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ФИЛЬТРУЮЩИХ ПОРТАТИВНЫХ СРЕДСТВ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ 05.13.01 – Системный анализ, управление и обработка информации (химическая технология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва 2007 Работа выполнена на кафедре Эколого-экономического анализа технологий в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального...»

«Шушеначев Ярослав Владимирович ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-КИНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ В ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННОЙ СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ: ОПРЕДЕЛЕНИЕ d-ЭЛЕМЕНТОВ 02.00.02 – аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН доктор химических наук, профессор Научный руководитель : Шпигун Лилия Константиновна доктор химических...»

«ПАРФЕНОВ Олег Григорьевич Научные основы субхлоридной комплексной переработки нещелочного сырья на примере титаномагнетитовых и ильменитовых концентратов Специальность: 05.17.01. - Технология неорганических веществ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук Красноярск – 2009 1 Работа выполнена в Институте химии и химической технологи Сибирского отделения Российской академии наук Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор,...»

«ТАЛАН АЛЕКСЕЙ СЕРГЕЕВИЧ МОНО- И ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЛИПОФИЛЬНЫЕ АМИНОФОСФИНОКСИДЫ: СИНТЕЗ, КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЕ И ЭКСТРАКЦИОННЫЕ СВОЙСТВА 02.00.08 – химия элементоорганических соединений 02.00.02 – аналитическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань - 2008 Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных и элементоорганических соединений и на кафедре аналитической химии Химического института им. А.М. Бутлерова Государственного...»

«Кубышкина Елена Николаевна СИСТЕМА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ КРИТЕРИЕВ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДЛЯ ГЕОЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ТЕРРИТОРИИ Г. КАЗАНИ Специальность 25.00.36 – геоэкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата географических наук Казань – 2008 2 Работа выполнена в Институте экологии природных систем Академии Наук Республики Татарстан Научный руководитель : заслуженный деятель науки РТ и РФ, доктор географических наук, профессор Трофимов Анатолий Михайлович...»

«Горн Эдуард Петрович ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕПЛОФИЗИЧЕСКИХ И УСАДОЧНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК СПЛАВОВ И МАТЕРИАЛОВ ФОРМЫ ДЛЯ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ ПРОЦЕССА ФОРМИРОВАНИЯ СТАЛЬНЫХ ОТЛИВОК Специальность: 05.16.04 – Литейное производство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Санкт-Петербург – 2004 2 Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный политехнический...»

«ФОМИНА ЕВГЕНИЯ ВАЛЕРЬЕВНА СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ АМИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ДИМЕРНОЙ ЛИНОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ Специальность 02.00.03. – Органическая химия (химические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Дзержинск, 2010 www.sp-department.ru Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии Научно-исследовательский институт химии и технологии полимеров имени академика В.А. Каргина с опытным заводом (ФГУП НИИ полимеров) Научный...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.