WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Разработка мультиплексной пцр в реальном времени для детекции возбудителей орви человека

На правах рукописи

Сергеева Елена Игоревна

Разработка мультиплексной ПЦР в реальном времени для детекции

возбудителей ОРВИ человека

03.01.03 – молекулярная биология

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово-2013

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Научные руководители: Агафонов Александр Петрович, доктор биологических наук, ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заместитель генерального директора по научной работе Терновой Владимир Александрович, кандидат биологических наук, ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующий лабораторией молекулярной эпидемиологии ООИ Официальные Тикунова Нина Викторовна, доктор оппоненты: биологических наук, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, заведующая лабораторией молекулярной микробиологии Левагина Галина Михайловна, кандидат биологических наук, ИМБТ ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующая отделом разработки технологий и пилотного производства биопрепаратов

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится «06» декабря 2013 г. в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»» по адресу: 630559, р.п. Кольцово Новосибирского района Новосибирской области, тел. (383) 336-74-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан «31» октября 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, Г.П. Трошкова д-р биол. наук, проф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время известно более 200 вирусов, вызывающих ОРВИ у человека. Основные возбудители ОРВИ человека относятся к шести семействам: Orthomyxoviridae (вирусы гриппа), Paramyxoviridae (вирусы парагриппа человека 1–4, метапневмовирус человека, респираторносинцитиальный вирус человека), Picornaviridae (энтеровирусы, риновирусы), Coronaviridae (коронавирусы человека 229E, HKU1, NL63, OC43, SARS, MERS), Adenoviridae (аденовирусы человека), Parvoviridae (бокавирус человека).

В структуре общей инфекционной заболеваемости человека острые респираторные инфекции занимают первое место, являясь главной причиной временной нетрудоспособности, приводя к огромным экономическим потерям. По официальным данным, в 2010 году на территории Российской Федерации было зарегистрировано 28 238 271 случай острых инфекций верхних дыхательных путей, заболеваний гриппом – 27 363 случая [Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях (Форма 1) за январь-декабрь 2010]. В 2011 году – 30 729 617 случаев, заболеваний гриппом – 308 829 случаев [Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях (Форма 1) за январь-декабрь 2011].

В 2012 году – 28 423 135 случаев, заболеваний гриппом – 24 638 случаев [Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях (Форма 1) за январьдекабрь 2012].

Хотя острые респираторные вирусные инфекции человека и составляют группу заболеваний с похожими клиническими проявлениями, вызывающие их вирусные агенты значительно отличаются по патогенности и летальности для человека. В последнее время в фармакологии стремительно развиваются направления по разработке средств специфической противовирусной терапии.

Так, для лечения инфекций, вызванных вирусами гриппа, применяют ингибиторы нейраминидазы (занамивир, ланинамивир, озельтамивир); для респираторносинцитиального вируса – моноклональные антитела и малые интерферирующие РНК. Для лечения аденовирусных инфекций – цидофовир и рибавирин. Для лечения тяжелых случаев ОРВИ, вызванных метапневмовирусом человека – рибавирин и иммуноглобулины. Для терапии риновирусной и энтеровирусной инфекций применяют препарат «Enviroxime», нивелирующий процесс репликации вируса, а также «Pleconaril» ингибитор капсидных белков. Ведется активная разработка средств специфической терапии коронавирусных инфекций.

Таким образом, дифференциальная диагностика возбудителей ОРВИ человека позволяет скорректировать схему лечения и более эффективно использовать ресурсы системы здравоохранения.

Большинство вирусологических, серологических и иммунологических методов детекции агентов ОРВИ человека требуют значительных затрат времени, являются трудоёмкими и, как правило, выявляют один возбудитель ОРВИ.

Поэтому во всем мире «золотым стандартом» дифференциальной диагностики агентов ОРВИ человека являются методы на основе амплификации нуклеиновых кислот, которые позволяют детектировать одновременно несколько возбудителей ОРВИ человека в клинических образцах. На территории Российской Федерации в настоящее время существует единственный набор реагентов для идентификации генетического материала возбудителей ОРВИ человека – «АмплиСенс ОРВИскрин-FL» (ЦНИИЭ, Москва). Набор позволяет методом ПЦР в реальном времени выявлять в клиническом образце генетические маркёры 17 вирусов:

респираторно-синцитиального вируса человека, метапневмовируса человека, вирусов парагриппа человека 1, 2, 3 и 4, коронавирусов человека 229E, NL63, OC43, HKU1, риновирусов A–C, аденовирусов человека B, C, E и бокавируса человека.

Таким образом, создание набора реагентов для идентификации агентов ОРВИ человека методом мультиплексной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для детекции 20 видов и 5 субтипов возбудителей ОРВИ человека является чрезвычайно актуальной задачей, так как позволяет не только скорректировать лечение, но и изучить структуру заболеваемости ОРВИ. Эта задача заслуживает особого внимания, поскольку широких мониторинговых исследований в этом направлении на территории Российской Федерации и, в частности, в Новосибирской области до сих пор не выполнялось.

Цели исследования. Разработать мультиплексную ПЦР-РВ и набор реагентов на её основе для выявления генетических маркёров (РНК и ДНК) наиболее распространённых возбудителей ОРВИ человека: вирусов парагриппа человека 1–4; риновирусов A–C; метапневмовируса человека; бокавируса человека; аденовирусов человека B, C, E; коронавирусов человека 229E, HKU1, NL63, OC43, SARS; респираторно-синцитиального вируса человека; вируса гриппа В; вируса гриппа А, в т.ч. субтипов вируса гриппа А - H1N1 (сезонный вариант), H1N1(2009)pdm (пандемический вариант), H3, H5 и H7. Апробировать разработанный набор реагентов на клинических образцах от пациентов с диагнозом ОРВИ.

Задачи исследования.

1. Для разработки мультиплексной ПЦР в реальном времени, позволяющей детектировать генетические маркёры наиболее распространённых возбудителей ОРВИ человека: подобрать олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентные зонды; разработать внутренние, положительные и отрицательный контрольные образцы; оптимизировать состав реакционных смесей и температурно-временные параметры ПЦР.

2. На основе разработанного метода создать и охарактеризовать лабораторный вариант набора реагентов для детекции генетических маркёров возбудителей ОРВИ человека. Провести его сравнение с существующими аналогами.

3. Собрать коллекцию клинических образцов от пациентов г. Новосибирска с диагнозом ОРВИ. Получить суммарные РНК/ДНК и кДНК в реакции обратной транскрипции и провести апробацию разработанного набора реагентов в исследовании полученных ДНК и кДНК на наличие генетических маркёров возбудителей ОРВИ человека.

4. Изучить видовое разнообразие вирусов, обнаруженных в клинических образцах от пациентов г. Новосибирска с диагнозом ОРВИ.

5. Определить нуклеотидные последовательности фрагментов геномов, обнаруженных вирусов и изучить их генетическое разнообразие.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Разработан метод одновременной детекции 20 видов и 5 субтипов возбудителей ОРВИ человека на основе мультиплексной ПЦР-РВ. Показана эффективность его использования для исследования клинического материала.

Впервые в Западно-Сибирском регионе определена встречаемость геномов возбудителей ОРВИ человека негриппозной этиологии: вирусов парагриппа человека 1–4, риновирусов A–C, метапневмовируса человека, бокавируса человека, аденовирусов человека B, C, E, коронавирусов человека 229E, HKU1, NL63, OC43, SARS, респираторно-синцитиального вируса человека, а также смешанных инфекций в клинических образцах.

Определены нуклеотидные последовательности фрагментов геномов коронавирусов человека OC43, NL63 и 229E, респираторно-синцитиального вируса человека, вирусов парагриппа человека 1 и 3, бокавируса человека, циркулирующих в Западно-Сибирском регионе.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработана мультиплексная ПЦР в реальном времени для детекции возбудителей ОРВИ человека: вирусов парагриппа человека 1–4; риновирусов A– C; метапневмовируса человека; бокавируса человека; аденовирусов человека B, C, E; коронавирусов человека 229E, HKU1, NL63, OC43, SARS; респираторносинцитиального вируса человека; вируса гриппа В; вируса гриппа А, в т.ч.

субтипов вируса гриппа А - H1N1 (сезонный вариант), H1N1(2009)pdm (пандемический вариант), H3, H5 и H7. Мультиплексная ПЦР-РВ в условиях проделанных экспериментов демонстрировала следующие характеристики:

аналитическая чувствительность – 20–39 ГЭ/реакция, 1103–1104 в.ч./мл;

диагностическая чувствительность – 100%; аналитическая специфичность – 95,7– 100%; диагностическая специфичность – 100%.

2. В 61 (37%) образце обнаружены генетические маркёры одного вида вируса. В 28 (17%) образцах выявлены генетические маркёры 2 и более видов вирусов.

3. Основными этиологическими агентами ОРВИ в исследованной выборке образцов являются риновирусы (42 образца (25,6%)) и коронавирусы (29 образцов (17,6%)).

4. Максимальное видовое разнообразие возбудителей ОРВИ человека наблюдается в возрастной группе детей до 7 лет с пиком в группе 2–4 года.

Вклад автора. Создание коллекции образцов РНК, ДНК, кДНК, выделенных из клинических образцов от пациентов г. Новосибирска с диагнозом ОРВИ, собранных в 2011–2012 гг. Расчет и тестирование праймеров и флуоресцентных зондов для детекции возбудителей ОРВИ человека. Конструирование рекомбинантной плазмиды, создание коллекции трансформированных клеток E. coli. Получение штаммов пандемического вируса гриппа A/H1N1(2009) (совместно с Агафоновым А.П., Деминой О.К., Шиковым А.Н.). Выявление генетических маркёров возбудителей ОРВИ человека в клинических образцах, определение нуклеотидных последовательностей их геномов, филогенетический анализ (совместно с Терновым В.А.).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы и приложений. Библиография включает 420 работ (4 отечественных, 406 зарубежных, 10 электронных ресурсов). Работа иллюстрирована рисунками, включает 19 таблиц.

Апробация результатов диссертации и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Получен патент РФ № 2473702.

Полученные результаты исследований были доложены на российских и международных конференциях: V Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням (Москва, 25–27 марта 2013 г.); «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 5–7 июня 2013 г.); VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 24–26 ноября 2010 г.); II Международная конференция «Астана Биотех 2011» (г. Астана, Казахстан, 2011);

научно-практическая конференция «Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения»

(Новосибирск, 13 сентября 2012 г.).

Клинический материал. В работе использованы образцы мазков с носоглотки от 164 пациентов с диагнозом ОРВИ, поступившие в ГНЦ ВБ «Вектор» из ФБУЗ «ЦГиЭ в Новосибирской области», согласно приказу Роспотребнадзора № 88 от 17.03.2008, а также 94 образца мазков с носоглотки от здоровых доноров. Порядок проведения исследования одобрен этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор».

Вирусные штаммы. В исследовании были использованы штаммы вирусов гриппа:

А/Aichi/2/1968(Н3N2), A/Novosibirsk/1/2009(H1N1), A/Ekaterinburg/01/ (H1N1)v, A/Tomsk/01/2009(H1N1)v, A/Novosibirsk/02/2009(H1N1)v, A/Irkutsk/01/ 2009(H1N1)v, A/chicken/Kurgan/05/2005(H5N1), A/garganey/Crimea/2027/ (H7N8), В/Chita/01/2010, В/Chita/02/2010, В/Chita/03/2010, В/Chita/04/2010, В/Chita/05/2010; штамм респираторно-синцитиального вируса человека Long, штамм аденовируса человека Gomen, штамм коронавируса SARS Frankfurt 1.

A/chicken/Kurgan/05/2005(H5N1) получен из НИИ гриппа РАМН (г. СанктПетербург). Штаммы сезонного и пандемического вариантов вируса гриппа H1N1, штамм вируса гриппа A/garganey/Crimea/2027/2006(H7N8) выделены в ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирская обл.). Штаммы вируса гриппа В получены из ФБУЗ «ЦГиЭ в Читинской области». Штаммы Long, Gomen, Frankfurt 1 получены из ATCC.

Физический титр препаратов определяли методом электронной микроскопии.

Олигонуклеотиды синтезированы в ИХБФМ СО РАН (Новосибирск), ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирская обл.), ЗАО «Синтол» (Москва).

Выделение нуклеиновых кислот из клинического материала проводили с использованием наборов «РИБО-сорб» и «РИБО-преп» (ЦНИИЭ, Москва), реакцию обратной транскрипции – с использованием набора «Реверта-L»

(ЦНИИЭ, Москва).

Полимеразная цепная реакция проводилась с помощью HotStart Taq-ДНКполимеразы («Медиген», Россия), условия реакции подбирали эмпирически. В качестве референтной ПЦР тест-системы использовали: «АмплиСенс ОРВИскрин-FL» (ЦНИИЭ, Москва).

Исследование диагностических чувствительности и специфичности метода проводили согласно ГОСТ Р 53022.2-2008 и ГОСТ Р 53022.3-2008.

Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

Анализ последовательностей. Для сравнения определённых нуклеотидных последовательностей использовали последовательности прототипных изолятов из GenBank. Филогенетический анализ проводили с помощью программ MEGA5, TREE-PUZZLE, BLAST. Для оценки достоверности группирования применяли тест на стандартную ошибку длин ветвей и бутстреп-тест. Выравнивание последовательностей, филогенетический анализ проводили методами минимальной эволюции и «объединения ближайших соседей», построение филогенетических деревьев выполняли в программах MEGA5 и Lasergene 7.

Результаты собственных исследований и их обсуждение Дизайн праймеров и флуоресцентных зондов. Для детекции выбранных вирусных агентов была проведена работа по моделированию праймеров и флуоресцентных ДНК-зондов. Были построены массивы выравненных последовательностей, определены наиболее консервативные участки геномов, после чего с использованием пакетов программного обеспечения Vector NTI 8 и MEGA5 была проведена работа по конструированию специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов.

Разработка и апробация контрольных образцов для ПЦР-РВ. Для контроля проведения мультиплексной ПЦР-РВ были разработаны: отрицательный контрольный образец (ОКО), положительные контрольные образцы (ПКО) – на каждый детектируемый вирус, контроль выделения ДНК (ВКО-1) и совместный контроль выделения РНК и прохождения реакции обратной транскрипции (ВКО-2).

ОКО – 1ТЕ-буфер. Содержит все компоненты реакционной смеси кроме целевой вирусной ДНК/кДНК.

ПКО – препараты рекомбинантной ДНК, содержащей нуклеотидные последовательности для гибридизации праймеров и флуоресцентных ДНК-зондов.

ВКО-1 - эндогенный внутренний контроль выделения ДНК – праймеры и флуоресцентный ДНК-зонд, гомологичные последовательности конститутивного гена человека – гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH).

ВКО-2 - экзогенный внутренний контроль выделения РНК и обратной транскрипции – праймеры и флуоресцентный ДНК-зонд, гомологичные последовательности РНК-генома бактериофага MS2.

Для исключения конкурентной амплификации ВКО проводили оценку эффективности амплификации целевых ДНК в присутствии и отсутствии праймеров и флуоресцентных зондов к ВКО. Установлено, что амплификация ВКО не конкурирует с целевыми реакциями.

Оптимизация ПЦР в реальном времени. С использованием полученных плазмидных конструкций (ПКО) были подобраны условия оптимального проведения ПЦР-РВ. Эмпирически были выбраны рН реакционных смесей, концентрации MgCl2, фермента, праймеров и флуоресцентных зондов, температуры отжига праймеров и время инкубации для каждой стадии цикла.

Титрование рН проводили в диапазоне 8,0–9,0. Оптимальные значения рН для всех шести используемых смесей для проведения ПЦР лежат в диапазоне 8,4-8,6.

Для выбора оптимальной концентрации MgCl2 готовили реакционные смеси с последовательными разведениями в диапазоне 1,5-5,5 мМ. Оптимальная концентрация MgCl2 лежит в диапазоне 2,5-3,5 мМ (рис. 1).

Рис. 1. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации MgCl2 в реакционной смеси. 1 – 1,5 мM; 2 – 2,5 мM; 3 – 3,5 мM; 4 –4,5 мM; 5 – 5,5 мM;

6 – ОКО Концентрации прямого, обратного праймеров и флуоресцентных ДНК-зондов были подобраны эмпирически, для чего были приготовлены последовательные разведения олигонуклеотидов в диапазоне 0,1–0,6 мкМ в реакции.

Экспериментально было показано, что интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна концентрации праймеров в растворе и обратно пропорциональна концентрации ДНК-зондов. В разработанной мультиплексной ПЦР-РВ оптимальные концентрации прямого и обратного праймеров составили – 0,5–0,6 мкМ/реакция, флуоресцентного ДНК-зонда – 0,1 мкМ/реакция.

При выборе оптимальных параметров циклирования ПЦР температуру гибридизации праймеров варьировали в диапазоне 46-56 °C (рис. 2).

Экспериментально было показано, что оптимальная температура отжига праймеров для детекции выбранных вирусных агентов лежит в диапазоне 50– 52 °С.

Рис. 2. Зависимость интенсивности флуоресценции от температуры отжига праймеров (на примере смеси для детекции вируса гриппа А). 1 – 56,0 °C, 2 – 55,5 °C, 3 – 54,2 °C, 4 – 52,4 °C, 5 – 49,9 °C, 6 – 48,1 °C, 7 – 46,8 °C, 8 – 46,0 °C На последнем этапе оптимизации ПЦР-РВ были выбраны оптимальные временные промежутки этапов денатурации, отжига, элонгации. Оптимальный протокол мультиплексной ПЦР-РВ: активация полимеразы – 95 C°(5 мин), циклов – 95 C°(15 с), 51 C°(20 с) с детекцией по каналам FAM (470/510 нм), ROX (585/610 нм), Cy5 (625/660 нм), R6G (530/555 нм).

Оценка чувствительности и специфичности ПЦР-РВ. При определении основных диагностических характеристик разрабатываемой ПЦР-РВ оценивали аналитические и диагностические чувствительность и специфичность.

Аналитической чувствительностью считается минимальное количество ДНК, которое может быть определено методом ПЦР. Для оценки аналитической чувствительности готовили последовательные 10-кратные разведения рекомбинантных плазмид (ПКО). Значения аналитической чувствительности мультиплексной ПЦР-РВ варьируются в диапазоне 20–39 ГЭ/реакция.

Оценку аналитической чувствительности для вирусов гриппа А и В, вируса гриппа А субтипов H1(2009)pdm, H1, H3, H5 и H7, аденовируса человека, респираторно-синцитиального вируса человека, коронавируса SARS осуществляли с использованием препаратов с известной концентрацией вирусных частиц (в.ч.) (рис. 3). Предел чувствительности метода составил 1103– 1104 в.ч./мл.

Рис. 3. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации вирусных частиц в образце. А – вирус гриппа В, С – коронавирус, ассоциированный с тяжёлым острым респираторным синдромом (SARS). 1 – 1107 в.ч./мл, 2 – в.ч./мл, 3 – 1105 в.ч./мл, 4– 1104 в.ч./мл, 5 – 1103 в.ч./мл, 6 – 1102 в.ч./мл, 7 – ОКО Клиническая (диагностическая) чувствительность – это отношение числа образцов, точно классифицированных по результатам исследования как положительные, к числу всех исследованных образцов. Диагностическая чувствительность была оценена для 5 видов и 5 субтипов возбудителей ОРВИ человека. 94 клинических образца от условно здоровых доноров были контаминированы препаратами штаммов вирусов гриппа А (субтипы Н1(2009)pdm, Н1, Н3, Н5 и Н7) и В, аденовируса человека, респираторносинцитиального вируса человека и коронавируса SARS с известным физическим титром. Диагностическая чувствительность составила 100%.

Аналитическая специфичность была оценена эмпирически для каждой из смесей для ПЦР. Первичная оценка аналитической специфичности метода была проведена на образцах патогенов из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор», а также с использованием образцов кДНК и ДНК из коллекции отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ГНЦ ВБ «Вектор», видовая и родовая принадлежность которых была определена ранее. В проведённом эксперименте было исследовано 94 образца вирусных и бактериальных ДНК/кДНК. Не наблюдалось увеличения уровня флуоресценции при проведении ПЦР-РВ с ДНК и кДНК вируса простого герпеса человека 1 и 2, цитомегаловируса, вируса Эпштейна – Барр, энтеровирусов Echo 6, Echo 9, Echo 30, Echo 11, Echo 14, Echo 18, энтеровируса 71, Coxsackie B5, Coxsackie A4, Coxsackie A2, Coxsackie B1, Coxsackie B3, бактериями рода Streptococcus и видов Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumonia, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila. Однако было установлено, что возможно выявление близкородственных пикорнавирусов и аденовирусов. Таким образом, аналитическая специфичность метода составила 95,7–100%.

Диагностическая специфичность определялась как процент здоровых людей, имеющих истинно отрицательный результат анализа. Диагностическая специфичность была оценена в эксперименте при исследовании 94 клинических образцов от условно здоровых доноров и составила 100% для каждой из смесей.

Сравнение разработанного метода с аналогом. 164 клинических образца от пациентов с диагнозом ОРВИ исследованы с применением ПЦР тест-системы «АмплиСенс ОРВИ-скрин» (ЦНИИЭ, Москва) и разработанной мультиплексной ПЦР-РВ. Экспериментально было показано, что с использованием разработанного лабораторного варианта мультиплексной ПЦР-РВ маркёры вирусов были обнаружены в большем числе клинических образцов. Таким образом, для идентификации абсолютного большинства вирусов, вызывающих ОРВИ человека, чувствительность разработанного набора реагентов эквивалентна чувствительности коммерческого набора. Чувствительность разработанного набора реагентов превосходит чувствительность коммерческого набора при выявлении маркёров риновирусов и пяти видов коронавирусов.

Изучение видовой структуры возбудителей ОРВИ в исследуемой выборке образцов. В рамках проводимого исследования было проанализировано образца, собранных от пациентов в возрасте от 5 месяцев до 76 лет с диагнозом ОРВИ. Отрицательные в тесте на маркёры вирусов гриппа А и В в ФБУЗ «ЦГиЭ в Новосибирской области» образцы были исследованы на маркёры прочих возбудителей ОРВИ человека и повторно на вирусы гриппа в ГНЦ ВБ «Вектор».

В 89 (54%) из 164 исследованных образцов был обнаружен хотя бы один из вирусных агентов (рис. 4). В большинстве клинических образцов – 61 (37%) – был обнаружен один вид вируса. В 28 (17%) образцах был выявлен генетический материал 2 и более вирусов.

Рис. 4. Структура заболеваемости ОРВИ в исследованной выборке. РСВ – респираторно-синцитиальный вирус человека После этого была оценена встречаемость каждого из исследуемых вирусных агентов в анализируемых клинических образцах, в том числе в составе смешанных инфекций (рис. 5). В абсолютном большинстве образцов были обнаружены риновирусы – 42 (25,6%). В 29 (17,6%) исследованных образцах обнаружены коронавирусы человека. В структуре коронавирусной инфекции преобладали коронавирусы I серогруппы – NL63 и 229E (23/14,0%).

Коронавирусы II серогруппы – HKU1 и OC43 – встречались значительно реже (6/3,6%). Вирусы парагриппа человека были обнаружены в 24 (14,6%) клинических образцах. При этом в структуре заболеваемости преобладали вирус парагриппа человека 3 (13/7,9%) и вирус парагриппа человека 1 (11/6,1%). Вирус парагриппа человека 2 обнаружен только в 1 (0,6%) образце. Вирус парагриппа человека 4 не был обнаружен ни в одном исследованном образце. Респираторносинцитиальный вирус человека обнаружен в 11 (6,7%) образцах. Наименее часто обнаруживались бокавирус человека – в 8 (4,9%) образцах, аденовирусы человека – в 1 (0,6%) образце и метапневмовирус человека – в 3 (1,8%) образцах.

Рис. 5. Встречаемость исследуемых возбудителей ОРВИ в анализируемых клинических образцах. РСВ – респираторно-синцитиальный вирус человека В рамках проводимого исследования было изучено видовое разнообразие возбудителей ОРВИ в различных возрастных группах пациентов (рис. 6).

Согласно возрасту и социальному статусу было выделено 7 групп:

1. дети до 2 лет, не посещающие дошкольные учреждения (25 образцов);

2. дети младшего дошкольного возраста от 2 до 4 лет (29 образцов);

3. дети старшего дошкольного возраста от 5 до 7 лет (21 образец);

4. дети школьного возраста от 8 до 16 лет (29 образцов);

5. взрослые от 17 до 30 лет (26 образцов);

6. взрослые от 31 до 51 года (23 образца);

7. взрослые старше 52 лет (11 образцов).

Рис. 6. Распределение агентов ОРВИ человека в различных возрастных группах пациентов. РСВ – респираторно-синцитиальный вирус человека Было установлено, что пик видового разнообразия возбудителей ОРВИ человека в структуре заболеваемости приходится на возрастные группы детей до 7 лет, распределяясь по возрастанию в группах в следующем порядке: 5–7 лет < до 2 лет < 2–4 года. Отмечается также пик видового разнообразия агентов ОРВИ в группе социально активных взрослых 17–30 лет.

Исследование генетического разнообразия обнаруженных возбудителей ОРВИ человека. Для всех ПЦР-положительных образцов дополнительно проводили определение нуклеотидной последовательности фрагмента генома вируса. В результате проделанной работы был проведен анализ определённых нуклеотидных последовательностей вирусных геномов, по результатам анализа были построены семь филогенетические деревьев.

Для четырёх обнаруженных вариантов коронавируса человека NL63 были определены нуклеотидные последовательности фрагмента S-гена длиной 200– 214 н.о. (рис. 7). Филогенетический анализ показал, что обнаруженные варианты кластеризуются отдельно от всех доступных в международной базе данных GenBank вариантов вируса ветвь, кроме единственного, обнаруженного в Канаде в 2002 г.

Рис. 7. Филогенетическое древо, построенное по нуклеотидной последовательности фрагмента S-гена коронавируса NL63 (200 н.о.). Анализ проведён методом объединения ближайших соседей. Цифры около узлов отражают индекс поддержки ветвей.

– исследованные изоляты Для 7 вариантов респираторно-синцитиального вируса были определены нуклеотидные последовательности фрагмента F-гена длиной 511–530 н.о. (рис. 8).

Построенное филогенетическое дерево демонстрировало наличие двух клад. Два обнаруженных варианта вируса ложились в первую кладу (серогруппа А), наиболее близкие изоляты ранее были выделены в Италии в 2007 г., Китае в 2012 г., Канаде в 2010 г. Большинство обнаруженных вариантов вируса ложились в кладу соответствующую серогруппе В, наиболее близкие варианты вируса ранее обнаружены в Японии в 2006 г., США в 2002 г., Саудовской Аравии в 2009 г.

Рис. 8. Филогенетическое древо, построенное по нуклеотидной последовательности фрагмента F-гена респираторно-синцитиального вируса человека длиной 511 н.о. Анализ проведён методом объединения ближайших соседей. Цифры около узлов отражают индекс поддержки ветвей.

– исследованные изоляты Для 15 обнаруженных вариантов риновирусов человека определены нуклеотидные последовательности фрагмента 5'-нетранслируемой области генома (5'-НТО) длиной 239–326 н.о. (рис. 9). Пять выявленных вариантов принадлежат виду С. Наиболее близкие к ним изоляты обнаружены в Мексике в 2008 г. и в 2011 г., а также в Великобритании в 2007 г. Два других выявленных варианта принадлежали виду А. Наиболее близкие к этой группе варианты вируса обнаружены в Бельгии в 2008 г. и Мексике в 2011 г. Ещё 7 выявленных вариантов ложились в отдельную кладу, наиболее близкий изолят ранее выявлен в Камбодже в 2010 г. Один из обнаруженных вариантов не укладывался ни в одну кладу.

Рис. 9. Филогенетическое древо, построенное по нуклеотидной последовательности фрагмента 5'-нетранслируемой области генома (5'-НТО) риновирусов человека длиной 239 н.о. Анализ проведён методом объединения ближайших соседей. Цифры около узлов отражают индекс поддержки ветвей.

– исследованные изоляты Для трёх вариантов бокавируса человека были определены нуклеотидные последовательности фрагмента VP1-гена, кодирующего белок капсида, длиной 206–240 н.о. (рис. 10). Исследованные варианты бокавируса ложились в одну кладу и демонстрировали достоверное отличие анализируемого участка генома от вариантов вируса ранее обнаруженных в г. Новосибирске в 2010 г., а также Китае в 2006 г., Японии в 2005 г. и Греции в 2008 г.

Рис. 10. Филогенетическое древо, построенное по нуклеотидной последовательности фрагмента VP1-гена бокавируса человека длиной 206 н.о.

Анализ проведён методом объединения ближайших соседей. Цифры около узлов отражают индекс поддержки ветвей.

– исследованные варианты, – варианты, обнаруженные в г. Новосибирске Таким образом, проведенный филогенетический анализ фрагментов нуклеотидных последовательностей геномов обнаруженных вариантов вирусов, вызывавших ОРВИ у жителей г. Новосибирска в эпидемический сезон 2011– 2012 гг. показал, что наиболее близкие изоляты вирусов ранее были выявлены в Европе, Америке, Азии и Африке в 1962–2011 гг. Выявленные варианты вирусов показывали генетическое разнообразие, что свидетельствует о циркуляции на территории Сибири вариантов вирусов, заслуживающих внимания и дальнейшего исследования.

ВЫВОДЫ

1. Разработана мультиплексная ПЦР в реальном времени, позволяющая выявлять генетические маркёры (ДНК и РНК) одновременно 20 видов и субтипов возбудителей ОРВИ человека: вирусов парагриппа человека 1–4, риновирусов A–C, метапневмовируса человека, бокавируса человека, аденовирусов человека B, C, E, коронавирусов человека 229E, HKU1, NL63, OC43, SARS, респираторно-синцитиального вируса человека, вируса гриппа В, вируса гриппа А, а также субтипов вируса гриппа А – H1N1 (сезонный вариант), H1N1(2009)pdm (пандемический вариант), H3, H5 и H7.

2. На основе разработанной мультиплексной ПЦР в реальном времени создан лабораторный вариант набора реагентов. Определены аналитические и диагностические характеристики набора: аналитическая чувствительность – 20– 39 ГЭ/реакция, 1103–1104 в.ч./мл; диагностическая чувствительность – 100%;

аналитическая специфичность – 95,7–100%; диагностическая специфичность – 100%. В параллельном исследование клинических образцов показано, что чувствительность разработанного набора превосходит чувствительность российского аналога.

3. Для набора реагентов, позволяющего детектировать РНК вирусов парагриппа человека 1-4, написан проект технических условий ТУ № 9398-037-056-64012отражающий его качественные характеристики. Разработан новый лабораторный регламент на производство набора реагентов для детекции вирусов парагриппа человека 1-4 ЛР № 05664012-016-13.

4. Разработанный набор реагентов апробирован на 164 клинических образцах от пациентов г. Новосибирска с диагнозом ОРВИ негриппозной этиологии, собранных в 2011–2012 гг. В 61 (37%) образце обнаружены генетические маркёры одного вида вируса, в 28 (17%) образцах выявлены генетические маркёры двух и более видов вирусов. Установлено, что основными этиологическими агентами ОРВИ в исследованной выборке были риновирусы (42/25,6%), коронавирусы человека (29/17,6%), вирусы парагриппа человека (24/14,6%) и респираторносинцитиальный вирус человека (11/6,7%), что соответствует структуре заболеваемости ОРВИ в других странах мира.

5. Обнаружено, что пик видового разнообразия возбудителей, вызывавших ОРВИ у жителей г. Новосибирска в 2011-2012 гг., приходился на возрастные группы детей до 7 лет, с максимумом в группе 2–4 года, а также на группу социально активных взрослых 17–30 лет.

6. Определены 58 нуклеотидных последовательностей фрагментов геномов семи видов вирусов, вызывавших ОРВИ среди жителей г. Новосибирска в 2011– 2012 гг. Полученные последовательности приняты к депонированию в международную базу данных GenBank. Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей, показал, что наиболее близкие изоляты ранее были выявлены в Европе, Америке, Азии и Африке в 1962–2011 гг.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Сергеева Е.И., Иванова Е.В., Швалов А.Н., Терновой В.А., Михеев В.Н, Агафонов А.П., Иванова Л.К., Сергеев А.Н. // Структура заболеваемости респираторными вирусными инфекциями в г. Новосибирске и Новосибирской области в эпидемический сезон 2011–2012 гг. // Вестник РАМН. – 2013. – № 6. – С. 21–25.

2. Сергеева Е.И., Терновой В.А., Демина О.К., Демина А.В., Корнеев Д.В., Шиков А.Н., Берилло С.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. // Разработка и испытание мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для идентификации вирусов, вызывающих острые респираторные инфекции человека // Молекул.

генетика микробиол. вирусол. – 2013. – № 4. – С. 32–37.

3. Шиков А.Н., Сергеева Е.И., Демина О.К., Терновой В.А., Рябинин В.В., Костина Е.В., Малкова Е.М., Синяков А.Н., Агафонов А.П. // Разработка ДНКбиочипа для выявления субтипов вируса гриппа А // Пробл. особо опасных инфекций. – 2012. – Вып. 2. – № 112. – С. 89–94.

4. Шиков А.Н., Семенцова А.О., Демина О.К., Сергеев А.А., Берилло С.А., Сергеева Е.И., Винокурова А.В., Ишенина А.В., Терновой В.А., Агафонов А.П., Дроздов И.Г. // Генетическая изменчивость изолятов вируса гриппа А Н1N1, выделенных на территории России в 2009 году // Молекул. генетика микробиол.

вирусол. – 2011. – № 4. – С. 23–29.

5. Сергеева Е.И., Терновой В.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов для идентификации РНК коронавирусов видов 229E NL63 OC43 HKU1 методом гибридизационно-флуоресцентной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции // Патент РФ № 2473702, приоритет изобретения от 16 ноября 2011 г. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 января 2013 г.

1. Сергеева Е.И., Иванова Е.В., Швалов А.Н., Терновой В.А., Михеев В.Н., Агафонов А.П. Иванова Л.К., Сергеев А.Н. – Структура заболеваемости респираторными вирусными инфекциями в г. Новосибирске и Новосибирской области в эпидемический сезон 2011–2012 гг. // V Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням. Москва. 25–27 марта 2013 г. С. 362– 2. Сергеева Е.И., Иванова Е.В., Швалов А.Н., Терновой В.А., Михеев В.Н., Агафонов А.П., Иванова Л.К., Сергеев А.Н. – Изучение видового разнообразия агентов ОРВИ в г. Новосибирске и Новосибирской области в эпидемический сезон 2011–2012 гг. // «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций».

Санкт-Петербург. 5–7 июня 2013 г. С. 170.

3. Сергеева Е.И., Винокурова А.В., Агафонов А.П., Терновой В.А. – Диагностика вируса гриппа, вируса парагриппа, риновируса, метапневмовируса методом ПЦР в режиме реального времени // VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием “Молекулярная диагностика -2010».

Москва. 24–26 ноября 2010 г. С. 210.

4. Сергеева Е.И., Терновой В.А., Демина О.К., Демина А.В., Корнеев Д.В., Шиков А.Н., Берилло С.А., Ишенина А.В., Винокурова А.В., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. – Разработка мультиплексной обратно-транскриптазной ПЦР-тестсистемы для детекции вируса гриппа, респираторно-синцитиального вируса и аденовируса в режиме реального времени // 2-ая Международная конференция «Астана Биотех 2011». Астана, Казахстан. 10–11 октября 2011 г. С. 5. Сергеева Е.И., Терновой В.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н – Дизайн олигонуклеотидных праймеров и зондов для детекции 21 вируса, вызывающего острые респираторные заболевания у людей // 2-ая Международная конференция «Астана Биотех 2011». Астана, Казахстан. 10–11 октября 2011 г. С. 6. Сергеева Е.И., Максимов Н.Л., Терновой В.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. – Разработка ДНК-биочипа на основе технологии xMAP для детекции коронавируса ТОРС (SARS) // Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарноэпидемиологического благополучия человека: Сб. науч. тр. – Новосибирск, 2012.

– С. 371–377.

7. Сергеева Е.И., Шиков А.Н., Демина О.К., Демина А.В., Корнеев Д.В., Пьянков О.В., Терновой В.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. – Разработка набора для детекции вирусов, вызывающих острые респираторные заболевания у людей, на основе мультиплексного варианта ОТ-ПЦР в режиме реального времени // Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия человека: Сб. науч. тр. – Новосибирск, 2012. – С. 365–371.

Настоящая работа выполнена за счет финансирования по грантам:

Межгосударственная целевая программа ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии» на 2011–2015 годы по теме: «Разработка тест-систем для идентификации генетического материала вирусов – возбудителей инфекций в воде объектов питьевого водопользования» шифр «2011-16-МЦП/№ 29», ГК № 16.М04.12.0028; Государственный контракт по теме «Разработка олигонуклеотидных биочипов для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний II–III групп патогенности» в рамках федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009–2014 годы) ГК № 44-Д от 01.06.2012.





Похожие работы:

«ШОЛКИН Сергей Евгеньевич РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МИКРОПЛАЗМЕННОГО ОСАЖДЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПОКРЫТИЙ С ЭЛЕМЕНТАМИ НАНОСТРУКТУРЫ Специальность 05.16.01 — Металловедение и термическая обработка металлов и сплавов АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Санкт-Петербург-2010 Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный политехнический университет и ФГУП Центральный научно-исследовательский институт конструкционных материалов...»

«СЕМЕНОВ Константин Николаевич РАСТВОРИМОСТЬ ЛЕГКИХ ФУЛЛЕРЕНОВ В ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ Специальность 02.00.04 — Физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Санкт-Петербург 2010 г. www.sp-department.ru Работа выполнена на кафедре химической термодинамики и кинетики химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета Научный руководитель : Чарыков Николай...»

«Строков Олег Витальевич CОЗДАНИЕ СТАЛЕАЛЮМИНИЕВЫХ КОМПОЗИЦИОННЫХ МАТЕРИАЛОВ ПОВЫШЕННОЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ НА ОСНОВЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ХАРАКТЕРА ПЛАСТИЧЕСКОЙ ДЕФОРМАЦИИ МЕТАЛЛА В ОКОЛОШОВНОЙ ЗОНЕ ПРИ СВАРКЕ ВЗРЫВОМ Специальность 05.02.10 Cварка, родственные процессы и технологии АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Волгоград – 2010 Работа выполнена на кафедре Оборудование и технология сварочного производства в Волгоградском государственном...»

«Бурмакина Галина Николаевна МАФИЧЕСКИЕ ВКЛЮЧЕНИЯ И КОМБИНИРОВАННЫЕ ДАЙКИ В ПОЗДНЕПАЛЕОЗОЙСКИХ ГРАНИТОИДАХ ЗАПАДНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ: СОСТАВ, ПЕТРОГЕНЕЗИС Специальность 25.00.04 – петрология, вулканология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата геолого-минералогических наук Улан-Удэ 2013 1 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Геологическом институте Сибирского отделения РАН (ГИН СО РАН). - доктор геолого-минералогических...»

«Урбанская Маргарита Викторовна ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ СРЕДА КАК ФАКТОР ФОРМИРОВАНИЯ ШКОЛЬНОЙ ГОТОВНОСТИ РЕБЕНКА В УСЛОВИЯХ ПРЕДШКОЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ Специальность: 13.00.01 - общая педагогика, история педагогики и образования АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Санкт-Петербург 2010 Работа выполнена на кафедре психологии Санкт-Петербургской академии постдипломного педагогического образования Научный руководитель - доктор педагогических...»

«Шакирова Юлия Андреевна АНАЛИЗ ПРОСТРАНСТВЕННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ НАСЕЛЕНИЯ КАК КОМПЛЕКСНОГО ИНТЕГРАЛЬНОГО ПОКАЗАТЕЛЯ КАЧЕСТВА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ (НА ПРИМЕРЕ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН) Специальность 25.00.23. – Физическая география и биогеография, география почв и геохимия ландшафта АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата географических наук Ярославль 2006 2 Работа выполнена в отделе гидрологии Института экологии природных систем Академии наук...»

«Уваров Андрей Анатольевич РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЕВ ПОЛИТЕТРАФТОРЭТИЛЕНА ХИМИЧЕСКИМ ОСАЖДЕНИЕМ ИЗ ГАЗОВОЙ ФАЗЫ Специальность 05.27.06 - Технология и оборудование для производства полупроводников, материалов и приборов электронной техники Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Санкт-Петербург – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования...»

«НАУМОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В МЕТАЛЛСОДЕРЖАЩИХ ПОЛИИЗОЦИАНАТАХ И ПОЛИУРЕТАНАХ 02.00.06–Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань-2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Казанский государственный технологический университет (ГОУ ВПО КГТУ) доктор химических наук, профессор Научный руководитель : Давлетбаева...»

«ЯСИНСКИЙ ИГОРЬ ФЕДОРОВИЧ РАЗРАБОТКА НЕЙРОСЕТЕВОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ И КЛАССИФИКАЦИИ ДЕФЕКТОВ ТКАНИ НА МЕРИЛЬНО-БРАКОВОЧНОМ ОБОРУДОВАНИИ Специальность 05.02.13 - Машины, агрегаты и процессы (легкая промышленность) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Иваново 2007 Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ивановская государственная текстильная академия (ИГТА). Научный...»

«СУПРУН ОЛЬГА ВАСИЛЬЕВНА Полимерные комплексы сорбиновой кислоты и их антифунгальное действие Специальность: 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2006 www.sp-department.ru Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете имени Д.И.Менделеева Научный руководитель доктор химических наук, профессор Штильман М.И. доктор химических наук, Официальные оппоненты профессор Ямсков...»

«Пономаренко Сергей Анатольевич ТИОФЕНСОДЕРЖАЩИЕ КРЕМНИЙОРГАНИЧЕСКИЕ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОРГАНИЧЕСКОЙ ОПТОЭЛЕКТРОНИКИ 02.00.06 – высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора химических наук Москва – 2010 www.separtment.ru Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова РАН Официальные оппоненты : Член корр. РАН, доктор химических наук Громов Сергей...»

«Кириевская Дубрава Владимировна ОЦЕНКА УЯЗВИМОСТИ ЭКОСИСТЕМЫ ЧУКОТСКОГО МОРЯ ОТ ПОТЕНЦИАЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ПО ОСВОЕНИЮ ШЕЛЬФА Специальность 25.00.28 – Океанология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата географических наук Санкт-Петербург – 2013 2 Работа выполнена на кафедре промысловой океанологии и охраны природных вод ФГБОУ ВПО Российский государственный гидрометеорологический университет и в комплексной партии ФГУП ВНИИОкеангеология им....»

«Спиридонова Регина Романовна БИНАРНЫЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ИЗОЦИАНАТОВ И ЭПОКСИДОВ - МОДИФИКАТОРЫ ПОЛИОЛЕФИНОВ 02.00.06 — Высокомолекулярные соединения Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань - 2003 Работа выполнена на кафедре технологии пластических масс Казанского государственного технологического университета Научный руководитель : доктор технических наук, профессор Архиреев Вячеслав Петрович Официальные оппоненты : доктор...»

«ЖУРАВЛЕВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА РАЗРАБОТКА ГИДРОМЕТАЛЛУРГИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ АФФИНИРОВАННОГО СЕРЕБРА ИЗ ТЕХНОГЕННОГО СЫРЬЯ Специальность 05.17.02 – технология редких, рассеянных и радиоактивных элементов АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2012 г. Работа выполнена в опытно-производственном цехе (цех №19) ОАО Красноярский завод цветных металлов имени В.Н. Гулидова и на кафедре Химии и технологии редких и рассеянных...»

«Гоношилов Дмитрий Геннадьевич МОДИФИКАЦИЯ ПОЛИКАПРОАМИДНЫХ НИТЕЙ ОГНЕЗАЩИТНЫМИ СОСТАВАМИ НА ОСНОВЕ ФОСФОРБОРСОДЕРЖАЩЕГО ОЛИГОМЕРА Специальность 02.00.06-Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Волгоград 2011 www.sp-department.ru Работа выполнена в Волжском политехническом институте (филиале) Волгоградского государственного технического университета. Научный руководитель доктор технических наук, профессор...»

«ДАВЫДОВА Ольга Александровна Донорно-акцепторные инициирующие системы и роль кислорода в фотополимеризации акрилатов, эпоксидов, модификации антифрикционных композитов 02.00.06 - высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Нижний Новгород - 2008 www.sp-department.ru 2 Работа выполнена на кафедре природопользования Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ульяновский...»

«Иванов Никита Сергеевич ПЛЁНКИ ЛЭНГМЮРА-БЛОДЖЕТТ, СОДЕРЖАЩИЕ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ (ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕРРОЦЕНА, БЕРЛИНСКУЮ ЛАЗУРЬ И ЕЁ АНАЛОГИ) Специальность 02.00.11 коллоидная химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2012 www.sp-department.ru Работа выполнена на кафедре коллоидной химии химического факультета СанктПетербургского государственного университета...»

«Гусев Сергей Игоревич КОНТРОЛИРУЕМАЯ РАДИКАЛЬНАЯ ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ ВИНИЛОВЫХ МОНОМЕРОВ В ПРИСУТСТВИИ НИТРОЗОНАФТОЛАТОВ МЕТАЛЛОВ И ИОДИДОВ ЛАНТАНОИДОВ(II) 02.00.06 – высокомолекулярные соединения Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Нижний Новгород – 2009 www.sp-department.ru 2 Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений и коллоидной химии химического факультета Государственного образовательного учреждения высшего...»

«ЛАВРОВА ОКСАНА МУДАРИСОВНА Дегидрогалогенирование органических полигалогенидов апротонными неионогенными реагентами 02.00.03 – органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань-2009 Работа выполнена в Казанском государственном технологическом университете Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Газизов Мукаттис Бариевич Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор Коновалова Ирина Вадимовна...»

«КИМ АЛЛА ВИТАЛЬЕВНА ЭКОЛОГО-АНАЛИТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕТРАМЕТИЛТИУРАМДИСУЛЬФИДА 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2013 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации Научные руководители: доктор биологических наук, Королёв Владимир...»














 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.