Технология биологически активной добавки к пище на основе каротиноидов асцидии halocynthia aurantium
На правах рукописи
МОТОРЯ Екатерина Сергеевна
ТЕХНОЛОГИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ К ПИЩЕ
НА ОСНОВЕ КАРОТИНОИДОВ АСЦИДИИ
HALOCYNTHIA AURANTIUM
Специальности:
05.18.07 – биотехнология пищевых продуктов (биотехнология гидробионтов);
03.00.04 – биохимия — технические наук
и
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Владивосток – 2009 2
Работа выполнена в лаборатории биохимии гидробионтов Федерального государственного унитарного предприятия «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр (ФГУП «ТИНРО-Центр»).
Научный руководитель — доктор биологических наук, старший научный сотрудник Пивненко Татьяна Николаевна
Официальные оппоненты — доктор технических наук, профессор Подкорытова Антонина Владимировна — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Касьянов Сергей Павлович
Ведущая организация — Дальневосточный государственный университет
Защита диссертации состоится 25 декабря 2009 г. в 13 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 307.012.01 при ФГУП «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» по адресу:
690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4, факс: (4232) 300- e-mail: pivnenko@tinro.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ТИНРО-Центр».
Автореферат разослан «20» ноября 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук О.С. Темных
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Исследование химических компонентов, входящих в состав морских животных, в течение последних лет остается на пике интересов биохимиков, фармакологов и исследователей смежных специальностей. Обнаружение компонентов с новыми качественными характеристиками, изучение их структуры и биологической активности позволяет выявить новые виды природных соединений, оценить их физиологическую активность (Еляков и др.
В настоящее время в нашей стране происходят существенные изменения в структуре промысла, наблюдается расширение списка объектов за счет видов ранее считавшихся не пригодными для пищевого использования. К ним относятся многие виды моллюсков, иглокожих, ракообразных. В странах АТР ассортимент привлекаемых к пищевому использованию гидробионтов значительно шире, он включает также асцидий — животных, принадлежащих к типу хордовых (Chordata), подтипу оболочников (Tunicata). Наибольшее количество их видов принадлежит к классу асцидий (Ascidiacea), химический состав которых характеризуется наличием специфических компонентов из разряда пептидов (Lee et al., 2001; Jang et al., 2002), каротиноидов (Ookubo, Matsuno, 1985; Choi et al., 1994a; Белорукова и др., 2006), алкалоидов (Еляков, Стоник, 2003; Agrawal et al., 2004; Issa et al., 2004), углеводов (Anno et al., 1974; Lee et al., 1998a; Усов и др., 2002).
В дальневосточных и арктических морях России широко распространена асцидия Halocynthia aurantium, содержащая в своих тканях каротиноиды в высоких концентрациях. Она обитает преимущественно на глубине от 1 до 65 м, и ее запасы позволяют производить промышленный вылов. Ранее предпринимались попытки обоснования пищевого использования этого вида асцидий, не получившие дальнейшего развития (Савватеева, 1990), поэтому биотехнологический и биогенный потенциал данного вида сырья не имеет объективной оценки.
Известны работы по использованию туники H. aurantium для получения БАД «Хаурантин», обладающей стресс-протекторной активностью (Кушнерова и др., 2000; Добряков, 2004). Однако предлагаемая технология обеспечивает выход каротиноидов, не превышающий 1 % их суммарного количества в исходном сырье.
Таким образом, широкий спектр биологической активности каротиноидов морских организмов свидетельствует о целесообразности их выделения и использования в лечебных и профилактических целях. Обоснование использования асцидии пурпурной в качестве источника каротиноидов позволит не только расширить сырьевую базу биопрепаратов, но и выявить особенности их состава и биологической активности, предложить новые рациональные технологии переработки.
Цель работы — исследование распределения и свойств биологически активных компонентов асцидии пурпурной как перспективного промыслового объекта, разработка эффективных технологий концентратов каротиноидов и определение их биологической активности.
Задачи исследования:
- исследовать технохимический состав тканей и органов асцидии пурпурной как основу для рекомендаций по ее переработке для производства БАД и пищевых продуктов;
- исследовать состав биологически активных компонентов в тканях асцидии для обоснования направлений их применения;
- исследовать качественный и количественный состав каротиноидов в тканях асцидии;
- определить структуру преобладающих каротиноидов, входящих в состав сырья и препаратов;
- определить рациональные параметры процесса экстракции и концентрирования каротиноидов;
- обосновать и разработать технологию масляных экстрактов каротиноидов в качестве БАД к пище;
- провести оценку безопасности и биологической активности БАД к пище, исследовать антиоксидантные и мембранотропные свойства препаратов;
Научная новизна. На основе новых инструментальных методов пересмотрены данные по составу биологически активных соединений в различных органах и тканях асцидии пурпурной H. aurantium, дана сравнительная характеристика качественного и количественного содержания азотистых соединений (свободных аминокислот, дипептидов, аминосахаров). Впервые проведен анализ компонентного состава каротиноидов тканей и органов асцидии и показано наличие 8 индивидуальных соединений в тунике методом ВЭЖХ. Выявлено значительное преобладание кислородсодержащих форм (ксантофиллов).
Значения молекулярных масс (с точностью до третьего знака), полученные массспектрометрией высокого разрешения, и характеры электронных спектров поглощения использованы для идентификации каротиноидов и построения структурных формул 5 преобладающих компонентов.
На основе сравнительного анализа способности каротиноидов асцидии к экстракции и реэкстракции в различных системах растворителей впервые разработан способ получения масляных концентратов, показано влияние органических кислот на процесс разрушения каротинопротеиновых комплексов асцидии. Показана зависимость процесса реэкстракции от липидного состава растительных масел и жиров морских организмов.
Разработана и научно обоснована технология БАД к пище «Экстракт асцидии масляный» из туники H. aurantium. Показателем подлинности сырья и продуктов на его основе может служить количественное содержание каротиноида галоцинтиаксантина.
Впервые исследовано влияние каротиноидов H. aurantium на текучесть мембран в модельных экспериментах. Показано, что каротиноиды из туники асцидии обеспечивают увеличение структурной стабильности, уменьшение текучести и повышение термостабильности мембраны в жидкокристаллическом состоянии. Установлены антиоксидантная и иммунотропная активности БАД к пище «Экстракт асцидии масляный».
Практическая значимость состоит в обосновании способов утилизации ранее не используемого вида морских организмов; разработке рекомендаций по комплексной безотходной переработке асцидии пурпурной, включающей создание БАД направленного типа действия; разработке технологии концентрированных масляных экстрактов каротиноидов.
Разработана и утверждена нормативная документация на «Асцидию пурпурную — сырец» ТУ 9253-308-00472012-06, «Асцидию пурпурную мороженую» ТУ 9265-311БАД к пище «Экстракт асцидии масляный» ТУ 9283-315-00472012-07.
По результатам экспертной оценки и санитарно-гигиенических исследований в Федеральном центре Госсанэпиднадзора РФ «Экстракт асцидии масляный» соответствует требованиям СанПиН и зарегистрирован как БАД к пище (санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.13.003.Т.002367 от 31.10.2007).
Реализация результатов исследования. В настоящее время промышленный выпуск БАД к пище «Экстракт асцидии масляный» (субстанция) осуществляется на экспериментальном участке ФГУП «ТИНРО-Центр», конечная форма производится в ООО «Биополимеры». Установлена экономическая эффективность производства БАД.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на «XII Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации» (Таиланд, 2007); на конференции «Современное состояние водных биоресурсов», посвященной 70-летию С.М. Коновалова (Владивосток, 2008); на 9-й Тихоокеанской международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2008); на научной конференции «Иммуномодуляторы природного происхождения» (Владивосток, 2009).
Основные положения, выносимые на защиту По совокупным признакам (распространению, химическому составу и составу БАВ) асцидия пурпурная Halocynthia aurantium является наиболее перспективным видом асцидий Дальневосточного региона России для использования в пищевой промышленности.
Исследование каротиноидов асцидии H. aurantium методами ВЭЖХ и массспектрометрии позволяет выделить и идентифицировать преобладающие компоненты. В качестве показателя подлинности сырья и продуктов на его основе может быть использован галоцинтиаксантин.
Технология масляного экстракта асцидии H. aurantium позволяет получать кислородсодержащие каротиноиды (ксантофиллы) в виде концентрированных препаратов, обладающих широким спектром биологической активности.
Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 – в изданиях, рекомендованных ВАК и один патент на изобретение Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальную часть, выводы, список цитируемой литературы, содержащий 215 источников, в том числе 140 зарубежных. Работа изложена на 141 странице, содержит 31 таблицу, 30 рисунков и 8 приложений.
Благодарности. Я искренне благодарна своему научному руководителю Т.Н. Пивненко за помощь и наставления при написании диссертации, а также выражаю признательность П.А. Задорожному, В.Г. Рыбину, Н.М. Саниной за помощь в работе и полезные советы, Н.М. Купиной за ценные замечания по улучшению структуры работы.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ
Введение. Обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы.Глава 1. Обзор литературы. Проведен анализ отечественной и иностранной научной и патентной литературы о химическом составе асцидий, распространении каротиноидов и методах выделения их из природных источников. Показано, что асцидии рода Halocynthia характеризуются наличием высоких концентраций каротиноидов в тунике и мантии, которая в странах АТР является ценным пищевым сырьем. Показано, что каротиноиды проявляют ярко выраженный антиоксидантный эффект, являющийся основным механизмом их биологической активности. Каротиноиды обладают мембранотропной, иммуномодулирующей, противоопухолевой, противоатеросклеротической и противоишемической активностями, способны защищать ДНК от мутаций, воздействовать на экспрессию генов. Показаны существенные различия в биологической активности ксантофиллов (преобладающих в морских организмах) и каротинов (преобладающих в растениях). Проанализированы технологические подходы к получению препаратов каротиноидов. Показана необходимость учета особенностей химического состава объекта, подбора условий, обеспечивающих стабильность, высокий выход и адекватные экономические затраты.
Глава 2. Объекты, материалы и методы исследований. Объектами исследований являлись асцидии H. aurantium, выловленные в зал. Петра Великого (Японское море), а также Styela clava. Сбор H. aurantium проводили в марте, августе и ноябре 2006–2009 гг., S. clava – в июне 2006 г. Материалом исследований служили: ткани и органы асцидий; подсолнечное, льняное, рапсовое и оливковое масла; жиры морских организмов, полученные в лаборатории БАД и фармпрепаратов ФГУП «ТИНРО-Центр»; ДПФХ 99 %-ной чистоты (Sigma Chemical Co, США).
Массовую долю воды определяли по ГОСТу 7636-85. Содержание общего азота — по методу Кьельдаля на приборе «Kjeltec 2300» (Foss, Швеция). Содержание связанных аминокислот устанавливали после 24 ч гидролиза обезжиренной ацетоном ткани в 6 N HCl. Свободные аминокислоты экстрагировали 70 %-ным водным этанолом. Состав аминокислот определяли в стандартных условиях на аминокислотном анализаторе «L-8800» (Hitachi, Япония). Экстракцию липидов проводили по методу Фолча (Folch et al., 1957). Общее содержание фосфолипидов и их отдельных классов устанавливали по методу Васьковского и Костецкого (Vaskovsky et al., 1975). Жирные кислоты анализировали на газожидкостном хроматографе «GC-16А» (Shimadzu, Япония). Содержание углеводов определяли антроновым методом (Кочетков, 1967). Содержание гексозаминов и сульфат-ионов — спектрофотометрически согласно фармакопейной статье (ФС № 42-1286-99). Минеральный состав устанавливали в лаборатории прикладной экологии и токсикологии ТИНРО-Центра методом атомноабсорбционной спектроскопии на пламенно-эмиссионном спектрофотометре «АА-855» (Nippon Jarrel Ash, Япония). Количественное содержание каротиноидов определяли спектрофотометрическим методом (Карнаухов, 1988). Состав каротиноидов анализировали высокоэффективной жидкостной хроматографией на приборе «LC-6A» (Shimadzu, Япония). Исследование токсичных элементов, радионуклидов и микробиологических контаминантов осуществляли согласно СанПиН 2.3.2.1078-01. Согласно известным методам определяли фагоцитарную и бактерицидную активности нейтрофилов (Лебедев, 1990; Хаитов, 1995) и антиокислительную активность крови (Бородин, Арчаков, 1987; Чумак и др., 1992). Мембранотропную активность каротиноидов определяли методом дифференциальной сканирующей калориметрии на приборе «ДСМ-2M» (НПО «Биоприбор», Пущино, Россия).
Глава 3. Результаты и обсуждение. Технохимическая характеристика асцидий.
Показано, что размерно-массовый состав асцидии H. aurantium значительно варьирует в зависимости от сезона. Наибольшая предельная масса животного зафиксирована в августе (398 г), наименьшая – в марте (25 г), на долю гемолимфы приходится 40–49 %, желудка с содержимым – 15–32 %, туники – 10–20 %, подошвы – 6–9 %, мантии – 6–7 %, пищеварительной железы – 1,4–1,9 %, гонад – 1,2–1,8 % общей массы.
В результате исследования химического состава асцидии H. aurantium показано (табл.
1), что ткани и органы животного значительно обводнены (85–90 %) и только жестко структурированная внешняя оболочка — туника — содержит до 80 % воды. Все ткани H. aurantium отличаются низкой концентрацией белка: в мантии содержится 10 % общей массы, в гонадах – 9 %, в тунике – 8 %, в пищеварительной железе – 5 %.
Общий химический состав асцидии H. aurantium, % от общей массы, среднее ± Примечание. Прочерк – нами не определено.
При исследовании аминокислотного состава асцидий установлено, что преобладающими протеиногенными кислотами являются глутаминовая (11–16 %), аспарагиновая кислоты (10–13 %), лизин, лейцин, аргинин. Содержание незаменимых аминокислот в белках тканей асцидии H. aurantium составляет 35–37 % общей суммы кислот, в тунике их количество значительно ниже. По сравнению с идеальным белком наблюдается дефицит лейцина, изолейцина, фенилаланина и некоторых других.
Ткани асцидий также содержат значительное количество свободных аминокислот (САК). Содержание САК уменьшается в ряду пищеварительная железа туника мантия.
Во всех тканях преобладает аминосульфокислота таурин (33–47 % общего количества аминокислот), что типично для морских организмов. Для гонад асцидии наблюдается значительная сезонная изменчивость количества САК. Относительно высокое содержание таурина, глицина и пролина определяется осморегулятивными функциями этих аминокислот, их соотношение отличает этот класс животных как от беспозвоночных, так и от позвоночных. Отдельно рассмотрен состав протеиногенных и свободных аминокислот в гемолимфе, суммарное содержание САК и таурина в пересчете на сухую массу в этой ткани наиболее высоко и превышает таковое в тунике, мантии и внутренних органах в 8–25 раз.
Количество липидов асцидии пурпурной в мантии, тунике, пищеварительной железе не превышает 1 % общей массы, только в гонадах их содержание около 2 %. На долю фосфатидилхолина приходится 44–54 % суммы фосфолипидов. Содержание полиеновых жирных кислот 25–48 % суммы кислот в зависимости от органа. Количество углеводных компонентов в асцидии невелико – около 1 %, только туника содержит углеводы (предположительно сульфатированный хитин «туницин» (Anno et al., 1974)) в значимых количествах — 12 %.
Для сравнения и определения возможности использования был исследован химический состав другого массового вида асцидий – S. clava, которая значительно меньше по размеру: масса одной особи не превышает 20 г. Доля белковых соединений S. clava также невелика и составляет 5,5 % в тунике и 7,5 % общей массы в остальных органах. Количество аминокислот, образующих белок, в асцидии S. clava ниже, чем в H. aurantium, а распределение САК подобно: во внешней оболочке содержание таурина – 33 %, во внутренних органах – 29 %.
Проведено сравнение содержания каротиноидов в различных видах асцидий и показано, что только H. roretzi (туника) и H. aurantium (туника и мантия) содержат значительное количество каротиноидов (табл. 2). Обнаружена сезонная изменчивость содержания каротиноидов в тунике: наибольшая концентрация наблюдается в марте. Для других органов заметных сезонных различий не наблюдали. В целом, содержание каротиноидов асцидий уменьшается в ряду туника мантия пищеварительная железа гонады.
В тканях и органах асцидии пурпурной содержится ряд физиологически важных минеральных элементов: K, Ca, Mg, Zn, Fe, Mn, Cu. Установлено, что гемолимфа асцидии включает большое количество ванадия — 220 мкг/г сухого веса, что предполагает возможность рассмотрения ее в качестве перспективного источника для получения препаратов, обогащенных этим элементом.
Содержание каротиноидов в некоторых видах асцидий, мг/100 г сырой ткани Halocynthia Halocynthia Styela plicata Bothryllus schlosseri Bothryllus violaceus Amoroucium plicif Ciona intestinalis Ascidia zara Didemnum moseleyi Polycitor proliferus * Вместе с содержимым желудка.
Санитарно-эпидемиологическая оценка содержания токсичных элементов (ртути, свинца, мышьяка и кадмия), а также радионуклидов показала, что в тканях асцидии данные элементы не достигали предельно допустимых уровней, определяемых СанПиН 2.3.2.1078.
По микробиологическим показателям, включающим определение парагемолитических вибрионов – возбудителей пищевых токсикоинфекций, асцидия пурпурная также соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1078.
Полученные результаты позволяют предложить следующие направления для переработки тканей и органов асцидии пурпурной:
1. Пищевое использование — мантия асцидии целиком;
2. БАД к пище и лекарственные препараты: экстракты туники и мантии – источники каротиноидов; гидролизаты мантии и гонад в качестве источника аминокислот, белков и каротиноидов; гемолимфа асцидии – в качестве источника свободных аминокислот и ванадия.
Из перечисленных направлений для дальнейшей работы были выбраны исследования каротиноидов, их состава, свойств и методов выделения.
Разработка технологии заготовки сырья. Показаны и обоснованы условия заготовки, транспортировки и хранения асцидии-сырца и асцидии мороженой. Предложено выпускать мороженую асцидию в неразделанном виде (целиком) и с разделкой на органы (мантия, туника). При разработке технологии мороженой продукции исследованы изменения концентрации каротиноидов в тунике и мантии в целой и разделанной асцидии. Установлено, что за 6 мес холодильного хранения при температуре минус 18 °С асцидии разделанной и за 4 мес — неразделанной сохраняется качество сырья, необходимое для создания БАД к пище на основе каротиноидов асцидии пурпурной.
Сравнительная характеристика способов выделения каротиноидов. Исследованы различные способы и условия экстракции каротиноидов для обоснования рационального сочетания таких показателей, как выход и стабильность каротиноидов. Показано, что для каротиноидов, находящихся в нативных тканях в ассоциации с белками и липидами, наиболее эффективным способом извлечения является первоначальная экстракция этанолом с последующей реэкстракцией растительным маслом. Использование системы этанол-гексан дает наилучший количественный выход, однако использование гексана не приемлемо в пищевых продуктах. Эффективности систем ацетон-масло и этанол-масло сравнимы. Однако в случае туники система этанол-масло показала лучший результат. При использовании такой двухступенчатой методики выход каротиноидов составляет 82,5 % по отношению к содержанию в исходной ткани (табл. 3). Результаты проведенных исследований защищены патентом № 2339387 «Способ получения биологически активной добавки из асцидии».
Выход каротиноидов при использовании различных способов экстракции, % Пищеварительная Примечание. За 100 % принято количество каротиноидов, извлекаемое системой ацетонгексан (Schiedt, Liaaen-Jensen, 1995) при следующих соотношениях: сырье : экстрагент (M/V) – 1 :
10; экстракт : реэкстрагент (V/V) – 5 : 1.
Для исследования влияния состава реэкстрагентов на эффективность перехода каротиноидов в жировую фракцию и получения препаратов, обогащенных каротиноидами, были использованы различные растительные масла (подсолнечное, рапсовое, оливковое и льняное) и жиры морских организмов (жир из печени сельдевой акулы, рыбный жир, подкожный жир кольчатой нерпы, жир из печени командорского кальмара) (рис. 1).
Рис. 1. Способность растительных масел и жиров морских организмов различного состава реэкстрагировать каротиноиды из этанольного раствора, при концентрации последних 0,04 мг/мл:
1 — подсолнечное, 2 – льняное, 3 – рапсовое, 4 – оливковое, 5 — жир из печени сельдевой акулы, 6 — рыбный жир, 7 — жир из подкожного сала нерпы кольчатой, 8 — жир из печени командорского кальмара. Соотношение этанольный экстракт : реэкстрагент – 5 : 1. Температура реэкстракции 38±2 °С По способности к реэкстракции каротиноидов наилучшие результаты показаны для подсолнечного и льняного масел, значительно меньше каротиноидов переходит в рапсовое и оливковое масла. Используя масла различного состава, можно получать варианты продуктов, различающиеся составом компонентов (прежде всего ПЖК) и биологической активностью, а также стоимостью. Морские жиры обладают более слабой способностью по сравнению с растительными маслами реэкстрагировать каротиноиды из этанольных растворов. Для создания новых продуктов, обеспечивающих стабилизацию рыбных жиров и синергетический эффект БАВ, в данном случае рекомендовано простое смешивание компонентов. При наиболее высоком содержании триглицеридов в подсолнечном масле (99%) и их самом низком содержании (40%) в жире из печени командорского кальмара зафиксированы максимальная (0,2 мг/мл) и минимальная (0,005 мг/мл) концентрации каротиноидов в экстрактах.
Исследование состава каротиноидов асцидии пурпурной. Для спектрофотометрического анализа каротиноиды из тканей и органов асцидии пурпурной выделяли по общепринятой методике (Schiedt, Liaaen-Jensen, 1995). Полученные экстракты имели окраску от желто-оранжевой до красной и типичный для каротиноидов трехпиковый спектр поглощения с четко выраженными главными максимумами 452–456 нм (рис. 2). Величина оптической плотности отражала концентрацию каротиноидов.
Учитывая сложный состав каротиноидов асцидии пурпурной и близкие значения Rf хроматографических зон при разделении методом ТСХ, нами был проведен качественный анализ пигментов туники обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с детектором на диодной матрице.
Рис. 2. Спектры поглощения гексановых экстрактов асцидии H. aurantium: 1 – гонады, 2 – пищеварительная железа, 3 – мантия, 4 – туника При подборе условий для разделения каротиноидов туники халоцинтии использовали элюенты метанол или ацетонитрил в градиенте концентрации. Однако, несмотря на большую элюирующую силу последнего (Энгельгардт, 1980), эффективность разделения смеси данных пигментов выше в водно-метанольной системе (рис. 3).
Рис. 3. Хроматограмма этанольного экстракта каротиноидов туники асцидии пурпурной (ChromSep (2x20 мм, 3 мкм), скорость элюирования 0,5 мл/мин, градиент – 0–20 мин 60–80 %, 20– мин 80–100 %, 30–45 100 %, температура колонки — 55 °С). Элюент метанол (А), ацетонитрил (Б).
Обозначенные пики соответствуют веществам, характеризующимся спектрами поглощения каротиноидов Были идентифицированы четыре превалирующих каротиноида туники асцидии пурпурной: астаксантин (3,3'-дигидрокси-,-каротин-4,4'-дион), аллоксантин (7,8,7',8'тетрадегидро-3,3'-дигидрокси-,-каротин),,-каротин-2,2'-дион и гидроксиэхиненон (4'гидрокси-,-каротин-4-он). Критериями идентификации и построения структурных формул каротиноидов служили значения их молекулярных масс, определенные с точностью до третьего знака, полученные масс-спектрометрией высокого разрешения и характеры электронных спектров поглощения (табл. 4, рис. 4).
Характеристики превалирующих каротиноидов туники асцидии пурпурной Рис. 4. Спектры электронного поглощения в видимой области в метаноле и структурные формулы идентифицированных каротиноидов туники асцидии H. aurantium Идентифицированные каротиноиды имеют в своем составе кислородсодержащие функциональные группы, которые определяют их высокую биологическую активность (Nishino, 1998; Ishikawa et al., 2008; Konishi et al., 2008; Hashimoto et al., 2009; Shen et al., 2009).
Критерий подлинности сырья и продуктов на его основе (выделение и характеристика галоцинтиаксантина). Для идентификации сырья и продуктов на его основе предложили использовать каротиноид галоцинтиаксантин (5,6-эпокси-3,3-дигидрокси-7,8дидегидро-5,6,7,8-тетрагидро-,-каротин-8-он) (рис. 5), который присутствует в значимых количествах только в асцидиях. Содержание его в сырье и экстрактах составляет около 6,5 % общего количества каротиноидов. Наличие галоцинтиаксантина в БАД и пищевых продуктах из асцидий свидетельствует об их подлинности. Особенность структуры этого каротиноида заключается в высоком содержании кислородсодержащих функциональных групп, что позволяет легко отделить его от остальных пигментов при разделении на прямой фазе ВЭЖХ.
Вещество, имеющее время удерживания 12,8-13,0 мин (рис. 5) и спектр поглощения в элюенте с максимумом 449 нм (рис. 6), представляет собой галоцинтиаксантин. В результате последующего анализа ВЭЖХ на обращенной фазе с масс-спектрометрическим детектированием в условиях химической ионизации положительными ионами было получено значение молекулярной массы этого каротиноида 598,854 а.е.м., что соответствует молекулярной массе галоцинтиаксантина.
Max= 449(nm) Рис. 6. Спектр поглощения в видимой области в элюенте (гексан-ацетон 7 : 3) и структурная формула галоцинтиаксантина Определение рациональных условий выделения каротиноидов из асцидии пурпурной. Обоснованы следующие рациональные условия и параметры ступенчатой этанольно-масляной экстракции каротиноидов: соотношение сырая туника : этанол (95 %) – 1 : 5;
температура экстракции – 20±2 °С; продолжительность экстракции – 24 ч; соотношение этанольный экстракт : масло : вода – 5 : 1 : 10; температура реэкстракции – 38±2 °С; продолжительность реэкстракции – 16 ч (рис. 7–12).
Рис. 7. Зависимость выхода каротиноидов Рис. 8. Зависимость выхода каротиноииз туники асцидии от массово-объемного соот- дов из туники асцидии от температуры эксношения туника : этанол тракции этанолом мг/100 г Рис. 9. Зависимость выхода каротиноидов Рис. 10. Влияние соотношения объемов из туники асцидии от продолжительности экс- этанольного экстракта и масла на концентритракции этанолом рование каротиноидов мг/мл Рис. 11 Зависимость реэкстракции каро- Рис. 12. Зависимость реэкстракции катиноидов маслом из этанольного раствора от тем- ротиноидов маслом из этанольного раствора от Результаты проведенных исследований были положены в основу технологии БАД к пище. На изготовление «Экстракта асцидии масляного. Биологически активной добавки к пище» разработана нормативно-техническая документация (ТИ № 36-317-07 к ТУ 9283-315Была исследована возможность использования сушеных тканей асцидии для получения каротиноидов вследствие ограниченного срока хранения мороженого сырья. Тунику и мантию асцидии сушили лиофильно при температуре конечного продукта 38±2 °С. Исходное содержание влаги в мантии составляло 85 %, в тунике – 80 %. После лиофилизации остаточная влажность в обоих случаях составляла 7,5 %. Установлено, что сушка тканей уменьшает экстракцию каротиноидов на 26 и 48 % соответственно для туники и мантии (рис. 13).
Рис. 13. Зависимость выхода каротиноидов при использовании тканей асцидии до и после сублимации. Массово-объемное соотношение ткань : этанол – 1 : 5. 1 – сырая туника, 1* — сублимированная туника, 2 – сырая мантия, 2* — сублимированная мантия.
Присутствующие в тунике асцидии каротиноиды находятся в ассоциации с белками и образуют стабильные комплексы. Известно, что органические и неорганические кислоты способствуют разрушению каротинопротеиновых комплексов (Ni et al., 2008). Эффективность их влияния объясняется кислотной силой и длиной углеродной цепи. В ряду кислот соляная – уксусная – молочная (CH3CH(OH)COOH) наиболее эффективное влияние оказывала последняя. Влияние на сырую и сушеную ткани было различным, в случае сублимированной туники использование молочной кислоты позволило увеличить выход каротиноидов в масляном экстракте на 15 % (табл. 5).
Влияние предварительной обработки сырья молочной кислотой сублимированная Разработка технологии БАД к пище «Экстракт асцидии масляный». Схема предлагаемого технологического процесса включает следующие стадии:
При использовании асцидии-сырца или мороженой неразделанной асцидии для получения туники и мантии обрезали подошву и ротовой сифон с продольным разрезом туловища, отгибали края туловища, удаляли внутренности, зачищали и промывали брюшную полость, отделяли тунику и мантию. К промытой и измельченной тунике добавляли 95 %-ный этиловый спирт в массово-объемном соотношение туника : этиловый спирт – 1 : 5 и выдерживали смесь в течение 24 ч при 20±2 °С. Этанольный экстракт, содержащий каротиноиды, отделяли от осадка фильтрованием, сливали в делительную воронку и добавляли растительное масло и дистиллированную воду, которая способствует расслоению образовавшейся при этом эмульсии на два отчетливых слоя. Смесь выдерживали в темном месте при постоянном перемешивании в течение 8 ч при 38±2 °С. В результате отстаивания наблюдали разделение фаз эмульсии и образование двух фракций – масляной и водно-этанольной. После отделения масляной фракции водно-этанольный слой направляли на регенерацию спирта. Выход конечного продукта составлял 1,0 ± 0,05 л на 1,0 кг сырья при концентрации каротиноидов в масляном экстракте 0,25±0,05 мг/мл из расчета содержания каротиноидов в исходной ткани 36,8±2,0 мг/100 г и выходе 82,5 %.
Одними из основных нормируемых параметров полученного продукта являются показатели: общее содержание каротиноидов и доля галоцинтиаксантина, наличие которого свидетельствует о подлинности продукта (табл. 6).
Физические и химические показатели БАД к пище «Экстракт асцидии масляный»
Доля галоцинтиаксантина от общего содержания каротиноидов, % 6,5 ± 0, При исследовании состава липидов в предлагаемом продукте было показано, что состав и содержание фосфолипидов, жирных кислот и других составляющих полностью соответствует компонентам используемого растительного масла, для контроля качества которого используют согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 следующие показатели: содержание полихлорированных бифенилов, величины кислотного и перекисного чисел. При исследовании контролируемых показателей при хранении при температуре 8±2 °С свыше 12 мес наблюдали увеличение кислотного числа более допустимого, поэтому продолжительность хранения была ограничена этим сроком.
Предложения по использованию вторичного сырья, образующегося на различных этапах производства БАД к пище «Экстракт асцидии масляный». В процессе изготовления масляного экстракта на стадии разделения фракций отделяется водно-этанольный экстракт, который рекомендовано направлять на восстановление этанола, а водный остаток, содержащий свободные аминокислоты, – на получение пищевых или кормовых добавок.
На стадии фильтрования образуется осадок, составляющий до 20 % исходной ткани.
Проведено сравнительное исследование углеводных фрагментов и сульфат-ионов в проэкстрагированной этанолом тунике асцидии H. aurantium и сульфатированном полисахариде «туницине» из асцидии H. roretzi (табл. 7). Показано сходство в соотношении количества глюкозаминов и сульфат-ионов и различие в содержании галактозаминов. Наличие сульфатированного полисахарида в осадке после фильтрования позволяет рекомендовать использование этого вторичного ресурса для создания нового биопрепарата.
Содержание полисахаридных фрагментов в тунике асцидии H. aurantium * Данные из работы Anno et al. (1974).
Исследование биологической активности каротиноидов асцидии пурпурной. Для оценки биологического действия препаратов исследовали мембранотропную, антиоксидантную и иммуномодулирующую активности.
Для изучения способности каротиноидов асцидии встраиваться в фосфолипидный слой определяли температуру фазового перехода (Tmax) и энтальпию перехода чистого дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) и комплекса ДПФХ-каротиноиды методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) (рис. 14).
ДПФХ – каротиноиды Рис. 14. ДСК-термограммы фазовых переходов гидратированного дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ), его смеси с 1,7 моль% каротиноидами туники H. aurantium (А) и растительным каротиноидом лютеином (Б) (Kostecka-Gugala et al., 2003). По оси ординат – теплопоглощение Добавление 1,7 моль% каротиноидов асцидии мало отражалось на Tmax, которая снижалась всего на 2 °С, но резко влияло на энтальпию фазового перехода, которая уменьшалась с 7,0 до 3,4 Дж/г. Одновременно с этим исчезал предпереход при 37 °С, который характерен для водной дисперсии ДПФХ. Добавление 5 моль% каротиноидов приводило к полному исчезновению калориметрического фазового перехода ДПФХ, в то время как лютеин (растительный каротиноид) оказывал подобный эффект при заметно больших концентрациях: при концентрации 5 моль% регистрировался отчетливый калориметрический переход ДПФХ (Kostecka-Gugala et al., 2003).
Функционирование иммунных клеток во многом зависит от межклеточных взаимодействий и мембраносвязанных рецепторов. Каротиноиды способны встраиваться и защищать мембраны клеток, сохраняя целостность иммунной клетки, уменьшая повреждения мембраны и ассоциированных рецепторов. Для оценки влияния каротиноидов асцидии на функциональную активность иммунных клеток исследовали фагоцитарную и бактерицидную активности нейтрофилов (по отношению к Staphylococcus aureus штамм 209) перитонеальной полости мышей, а также антиоксидантную активность (АОА) сыворотки крови мышей (табл.
8). При изучении эффектов были использованы дозировки, соответствующие адекватным суточным нормам и в 100 раз меньшие. Установлено выраженное иммуномодулирующее действие БАД к пище «Экстракт асцидии масляный». Данный препарат может быть рекомендован в качестве общеукрепляющего средства для снижения риска возникновения сердечно-сосудистых и воспалительных заболеваний.
Примечание. ОП – оптическая плотность; ФЧ – среднее число микроорганизмов, поглощенных одним фагоцитом; ФП – доля клеток, участвующих в фагоцитозе; АОА – антиокислительная активность крови; МДА – малоновый диальдегид.
Результаты токсикологической экспертизы показали, что образцы препаратов асцидии пурпурной не вызывали побочных реакций и гибели мышей. Препарат вводили внутригастарально в дозах, в 100 раз превышающих рекомендованные. Полученные данные позволили рекомендовать БАД «Экстракт асцидии масляный» для расширенных клинических испытаний.
В настоящее время промышленный выпуск БАД к пище «Экстракт асцидии масляный» осуществляется на экспериментальном участке ФГУП «ТИНРО-Центр» и ООО «Биополимеры». Определена экономическая эффективность производства. Выход конечного продукта (масляного экстракта) составляет 1,0 л из 1,0 кг сырья (туника), при концентрации каротиноидов в масляном экстракте 0,25±0,05 мг/мл. При выпуске продукции 100 л за 1 мес и рентабельности производства 30 % стоимость масляного экстракта составляет 982,29 руб.
за 1 л.
1. Научно обоснованы рекомендации по рациональному использованию органов и тканей асцидии пурпурной, технология БАД к пище на основе каротиноидов, обеспечивающая их концентрирование и сохранение биологической активности.
2. Среди наиболее распространенных видов асцидий, обитающих в российской зоне Японского моря, перспективной для использования в пищевой промышленности является асцидия пурпурная H. aurantium. Химический состав тканей (мантии, пищеварительной железы, гонад) характеризуется высоким содержанием воды (80–90 %), низким количеством азотистых соединений, включая белки (3,4–9,6 %) и свободные аминокислоты (0,1–3,3 %), малым содержанием липидов (0,2–0,6 %). Для внешней оболочки (туники) наиболее характерными соединениями являются каротиноиды и сульфатированные гексозамины.
3. Сравнительный анализ количественного содержания каротиноидов в различных органах асцидии H. aurantium показал, что концентрация каротиноидов уменьшается в ряду туника мантия пищеварительная железа гонады. В качестве их источника целесообразно использовать тунику (40 мг/100 г) и мантию (17 мг/ 100 г) 4. Каротиноиды H. aurantium представлены окисленными формами (ксантофиллами), состоящими из 8 основных компонентов, из которых 5 идентифицированы методами ВЭЖХ и масс-спектрометрией высокого разрешения: астаксантин, аллоксантин,,-каротин-2,2'дион, гидроксиэхиненон, галоцинтиаксантин. В качестве показателя подлинности сырья и продукции на основе асцидий может быть использован галоцинтиаксантин.
5. Обоснован выбор этанола в качестве экстрагента и растительного масла в качестве реэкстрагента для выделения и концентрирования каротиноидов с целью получения БАД к пище. Обоснованы рациональные режимы экстракции и реэкстракции каротиноидов: соотношение сырье-экстрагент 1 : 5, температура 20 °С, продолжительность экстракции 24 ч, соотношение масло-этанол – 1 : 5, температура 38 °С, продолжительность 8 ч.
6. Исследование экстракционной способности растительных масел различного происхождения показало, что наиболее высокий выход позволяет получить использование для реэкстракции подсолнечного и льняного масел. Установлено, что жиры морских животных обладают слабой способностью аккумулировать каротиноиды.
7. Мембраннотропная активность каротиноидов асцидии характеризуется снижением энтальпии фазового перехода ДПФХ с 7,0 Дж/г до 3,4 Дж/г и температуры фазового перехода на 2 °С, что свидетельствует о стабилизации мембран за счет уменьшения их текучести.
8. Каротиноиды H. aurantium проявляют значительный антиоксидантный эффект, а также обладают выраженным иммуномодулирующим действием, увеличивая бактерицидную и фагоцитарную активность нейтрофилов перитонеальной полости мышей 9. Технохимические решения производства БАД «Экстракт асцидии масляный» использованы при разработке нормативной документации: ТУ 9283-315-00472012-07, ТИ № 36-317-07 – и при внедрении препарата в промышленное производство. Новизна технических решений подтверждена патентом РФ № 2339387 «Способ получения биологически активной добавки из асцидии». Препарат внедрен в промышленное производство.
10. Результаты исследований безопасности и медико-биологической активности БАД «Экстракт асцидии масляный» явились научным обоснованием для использования препарата в качестве дополнительного источника каротиноидов (ксантофиллов), что подтверждено санитарно-эпидемиологическим заключением № 77.99.13.003.Т.002367 от 31.10.2007.
Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:
Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК 1. Пивненко Т.Н., Моторя Е.С., Задорожный П.А., Запорожец Т.С. Новые природные каротиноиды из дальневосточной асцидии в качестве иммуностимуляторов и антиоксидантов // Аллергология и иммунология. 2007. Т. 8, № 3. С. 339.
2. Задорожный П.А., Моторя Е.С., Пивненко Т.Н., Дроздова Л.И. Технохимическая характеристика и перспективы применения дальневосточной асцидии Halocynthia aurantium // Хранение и переработка сельхозсырья. 2009. № 7. С. 34-37.
3. Моторя Е.С., Пивненко Т.Н., Гажа А.С. и др. Исследование иммуномодулирующей и мембранотропной активностей каротиноидов из туники асцидии Halocynthia aurantium // Тихоокеанский медицинский журнал. 2009. №3. С. 28-32.
4. Моторя Е.С., Пивненко Т.Н. Исследование условий экстракции каротиноидов из туники асцидии пурпурной с использованием органических кислот и жиров морских организмов // Изв. ТИНРО. 2009. Т. 158. С. 388–392.
5. Задорожный П.А., Эпштейн Л.М., Ковалев Н.Н., Пивненко Т.Н., Якуш Е.В., Белорукова А.А., Моторя Е.С. Способ получения биологически активной добавки из асцидии :
Патент России № 2339387. 2008. Бюл. № 33.
Материалы конференций 6. Моторя Е.С., Пивненко Т.Н., Задорожный П.А. Каротиноиды асцидии пурпурной.
Способы выделения и критерий идентификации // Материалы научной конференции, посвященной 70-летию С.М. Коновалова «Современное состояние водных биоресурсов». Владивосток : ТИНРО-Центр, 2008. С. 914–918.
Подписано в печать 11.11.2009 г. Формат 60х84/16. 1 уч.-изд. л.
Отпечатано в типографии издательского центра ФГУП «ТИНРО-Центр»