Карнозин как фактор эндоэкологической защиты организма от повреждений, вызванных окислительным стрессом

На правах рукописи

Беляев Михаил Сергеевич

Карнозин как фактор эндоэкологической защиты организма от повреждений,

вызванных окислительным стрессом

Специальности:

03.00.16 – экология

03.00.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2008 1

Работа выполнена в Государственном учреждении «Научный Центр неврологии»

Российской Академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Федорова Татьяна Николаевна

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Орлова Валентина Сергеевна

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Муронец Владимир Израилевич Доктор биологических наук, профессор Коденцова Вера Митрофановна

Ведущая организация Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отто

Защита диссертации состоится «25» сентября 2008 г в 16.00 часов на заседании диссертационного совета Д.213.203.17 при Российском университете дружбы народов по адресу: 113093, г. Москва, Подольское шоссе, д. 8/5, Экологический факультет РУДН, ауд.

302.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат диссертации разослан « » 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета № Д.212.203. Доктор биологических наук, профессор _Чернышов В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эндоэкология является одним из важных разделов современной системной экологии, исследующей взаимоотношения биологических структур, как между собой, так и с окружающей средой. В свете научных интересов молекулярной и физиологической эндоэкологии изучение механизмов регуляции гомеостаза как многоклеточного организма в целом, так и клеток, входящих в его состав, является одной из важнейших задач этой науки (Реймерс, 1994).

Повреждающие факторы, как правило, являются индукторами окислительного стресса (ОС), который характеризуется повышением уровня высокотоксичных свободнорадикальных соединений и истощением эндогенной антиоксидантной системы организма. ОС может быть вызван как эндогенными, так и экзогенными неблагоприятными факторами – загрязняющими веществами окружающей среды, ионизирующим излучением, действием чужеродных организмов, влиянием экстремальных температур, недостатком кислорода. В соответствии с вышеизложенным, ОС можно рассматривать как неблагоприятный экологический фактор внутренней среды организма, называемый нами эндоэкологическим стрессом.

Головной мозг отличается особой чувствительностью к ОС, что обусловлено максимально активным потреблением кислорода этой тканью, высокой окисляемостью мембранных липидов и относительно низкой активностью эндогенной антиоксидантной системы. Поэтому многие заболевания ЦНС (сосудистые, нейродегенеративные и другие) протекают на фоне длительно существующего ОС, который в настоящее время рассматривается как одна из основных причин необратимой гибели мозга.

окислительного стресса в тканях, относятся гомоцистеин и продукты его спонтанного окисления (главным образом, гомоцистеиновая кислота), уровень которых в кровяном русле резко возрастает при нарушениях мозгового кровообращения (Yap, 2003; Зорилова, 2006).

Как правило, при хронических сосудистых заболеваниях головного мозга наблюдается гипергомоцистеинемия различной степени выраженности, вызванная нарушениями метаболизма, происходящими под влиянием разнообразных экзо- и эндогенных факторов.

Другой химический агент, 3-нитропропионовая кислота (3-НПК) является токсином; в мозге он необратимо ингибирует митохондриальную сукцинатдегидрогеназу и тем самым усугубляет функционально-метаболические нарушения мозга. В настоящее время действие этих соединений в условиях гипоксического и ишемического повреждения мозга и организма в целом исследовано недостаточно. Актуальным вопросом является и поиск природных нейропротекторов в условиях гипоксии/ишемии, отягощенной токсическим действием эндогенных и экзогенных химических агентов.

Целесообразным подходом к регуляции окислительного стресса в условиях поврежденного организма является применение антиоксидантов природного происхождения (Федорова и соавт., 1999; Boldyrev, 2006). С этой точки зрения перспективным соединением специфическим компонентом возбудимых тканей позвоночных животных, карнозин обнаруживает способность защищать мозг от окислительного стресса и его последствий в различных экспериментальных моделях (Boldyrev, Severin, 1990; Болдырев, 1992; Boldyrev, 2002). Он уменьшает экзайтотоксичность NMDA-рецепторов, предотвращает индукцию нейрональной смерти при действии неблагоприятных факторов, смягчает неврологическую симптоматику и уменьшает смертность животных после экспериментальной ишемии головного мозга (Федорова и соавт., 2002).

В клинико-биохимических исследованиях показано участие окислительного стресса в патогенезе гипоксических и ишемических поражений головного мозга (Суслина, 2000).

Оценка возможности применения карнозина в качестве дополнительного лечения больных с хронической дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ) является актуальной задачей.

Целью настоящего исследования явилась характеристика окислительных повреждений тканей в условиях эндоэкологического стресса и разработка подходов к нормализации метаболизма с помощью природного нейропептида карнозина.

Задачи исследования включали:

1. характеристику защитного эффекта карнозина на структурные элементы крови человека на фоне действия гомоцистеиновой кислоты (ГЦК) в опытах in vitro;

2. исследование терапевтического влияния карнозина на биохимические и физиологические проявления острой гипобарической гипоксии, отягощенной действием 3-НПК у крыс линии Вистар;

3. оценку протекторного эффекта карнозина на модели 3-сосудистой ишемии головного мозга на фоне введения ГЦК;

4. оценку терапевтического действия карнозина в комплексном лечении пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ).

Научная новизна. В работе описаны модели сочетанного действия различных эндоэкологических факторов, включающих гипоксию/ишемию, отягощенную воздействием 3-НПК или гомоцистеиновой кислоты.

Нейропептид природного происхождения карнозин был впервые применен нами в качестве дополнительного фактора лечения пациентов, страдающих ДЭ.

В работе показано, что защитные эффекты карнозина как на структурные элементы крови, так и на организм в целом, не ограничиваются его антиоксидантными свойствами, а включают мембраностабилизирующее и иммуномодулирующее действие. Выявлена способность карнозина улучшать когнитивные функции мозга у пациентов с ДЭ.

Проведенное исследование выявило многофункциональность карнозина как модулятора биологических структур.

Научно-практическая значимость. Обнаруженное нами положительное влияние карнозина при его введении животным в постгипоксический/постишемический период позволяют рекомендовать его для лечения больных с различными гипоксическими состояниями, а также для реабилитации лиц, подвергшихся воздействию гипоксии, и спортсменов в периоды интенсивных нагрузок.

Результаты проведенного клинико-биохимического исследования позволяют считать целесообразным введение карнозина в схему лечения пациентов, страдающих ДЭ.

Основные положения, выносимые на защиту. Эффекты карнозина в условиях эндоэкологического повреждения не ограничивается его антиоксидантными свойствами; на моделях in vitro карнозин проявляет мембраностабилизирующее действие на структурные элементы крови человека.

Карнозин оказывает защитное и регуляторное действие на биохимические и физиологические параметры, изменяющиеся в результате сочетанного действия эндоэкологических факторов - острой гипобарической гипоксии и 3-НПК - у крыс линии Вистар.

3-НПК и ГЦК являются важными факторами, усугубляющими развитие ОС в условиях гипоксии/ишемии головного мозга крыс Вистар. Карнозин проявляет свойства нейропротектора, предотвращая развитие неврологических и двигательных нарушений у животных, что коррелирует с нормализацией биохимических показателей.

Введение карнозина в схему лечения пациентов с ДЭ дополнительно к базовой терапии повышает уровень эндогенной антиоксидантной защиты, эффективность иммунокомпетентной системы, а также проявляет мембранопротекторное действие. Эти эффекты сопровождаются положительным действием карнозина на когнитивные функции мозга.

Апробация работы. Работа апробирована и рекомендована к защите 25 сентября г. на заседании кафедры системной экологии экологического факультета РУДН. Материалы диссертации были представлены на конференциях «Актуальные проблемы экологии и природопользования» (экологический факультет РУДН) в 2003 и 2005 гг., на XI Международном симпозиуме «New frontiers of neurochemistry and neurophysics on diagnosis and treatment of neurological diseases» в 2003 г. в г. Мартине (Словакия), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет) в 2008 г., на I Национальном Конгрессе по болезни Паркинсона и расстройствам движений, 2008 г. (Москва).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе статьи в журналах, входящих в список ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на … страницах машинописного текста, содержит.. таблиц и иллюстрирована.. рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, раздела, отражающего результаты собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, состоящего из... отечественных и.. зарубежных источников.

Материалы и методы экспериментальных и клинико-биохимических исследований Лабораторные животные. Экспериментальные исследования были проведены на 160 крысах-самцах линии Вистар, содержавшихся в стандартных условиях вивария. В работе были использованы две модели, сопровождающиеся развитием окислительного стресса.

Острая гипобарическая гипоксия, отягощенная введением 3-НПК (Стволинский, Федорова, 2002), создавалась в барокамере при снижении давления до величины 140 мм рт.

ст. Для дальнейших экспериментов отбирали животных, сохранявших дыхательную активность в условиях гипоксии. Сразу после гипоксического эпизода крыс разделяли на групп по 12 особей в каждой. Животным первой группы вводили 3-НПК (30 мг/кг массы тела), второй - карнозин (100 мг/кг массы тела), третьей - 3-НПК в сочетании с карнозином, четвертой – физиологический раствор; контрольную группу составили интактные животные.

Все препараты вводили ежедневно в течение 6 дней. Развитие неврологических нарушений оценивали с помощью специально разработанной шкалы (Федорова и соавт., 2002). Для оценки двигательной и мышечной активности животных (перед началом и в конце эксперимента) тестировали в тесте «открытое поле». В конце эксперимента регистрировали смертность, неврологическую симптоматику, двигательную активность, активность Двухэтапную окклюзию 3 магистральных сосудов головы (пережатие средней мозговой артерии и билатеральной сонной артерии) крыс линии Вистар с последующей 5суточной рециркуляцией (Pulsinelli, Brierly, 1994) осуществляли на фоне введения ГЦК. Все вещества животным вводили интраперитонеально: ГЦК в первый день операции и последующие 4 дня (180 мг/кг), карнозин за 1 час до ишемии (200 мг/кг) и в последующие дня (100 мг/кг ежедневно). Животные контрольной группы получали физиологический раствор.

Для оценки памяти и способности к обучению животных тестировали в водном лабиринте Морриса за 1 сутки до ишемии и на 3 сутки после ишемии, регистрируя поведение животных в бассейне с помощью специально разработанной программы (Махро и соавт. 2008).

Применение карнозина в лечении больных с хронической дисциркуляторной В работе представлены биохимические результаты комплексного энцефалопатией.

клинико-биохимического обследования пациентов с хронической ДЭ. Диагностику и лечение осуществляли в отделении острых нарушений мозгового кровообращения Научного в. н. с., к.м.н., Б.А. Кистенев). Исследование было выполнено двойным слепым плацебо контролируемым способом. Под наблюдением находилось 42 пациента (мужчины и женщины) с хронической ДЭ в возрасте от 32 до 79 лет. В группу, получавшую базовую терапию, вошло 20 пациентов; в группы, получавших дополнительно карнозин (в суточной дозе 0,75 г или 2,0 г), входило по 11 пациентов. Длительность исследования составила день. Результаты были сопоставлены с данными, полученными при аналогичном исследовании крови здоровых доноров.

В качестве источника карнозина использовали биоактивную добавку «Севитин» (ОАО «Медтехника», Россия) – таблетки, покрытые кислотоустойчивой оболочкой, содержащие 0,25 г карнозина.

Для оценки когнитивных функций головного мозга регистрировали вызванные потенциалы (ВП) Р300 на приборе «нейроМВП 4» («Нейрософт», Россия), анализируя параметры, используемые для оценки когнитивного ответа (Гнездицкий, 1997): сенсорный компонент и его амплитуду, а также латентность и амплитуду когнитивной составляющей пика P3. Оценку когнитивных функций головного мозга пациентов поводили совместно с сотрудниками лаборатории нейрофизиологии НЦН РАМН. Оценка когнитивных функций мозга была проведена сотрудниками лаборатории клинической нейрофизиологии, заведующий лабораторией - д.б.н., проф. Гнездицкий В.В.

Биохимические методы.

Активность супероксиддисмутазы в митохондриальной фракции мозга крыс (MnСОД) и в эритроцитах человека (Cu/Zn-СОД) определяли по подавлению скорости восстановления нитросинего тетразолия при генерации супероксидного анион-радикала в процессе окисления ксантина ксантиноксидазой при 560 нм (Mishra and Fridovich, 1972).

Активность моноаминоксидазы В (МАО В) в митохондриальной фракции мозга крыс определяли, используя в качестве субстрата бензиламин (Степанова и соавт., 2005).

Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в митохондриальной фракции мозга крыс определяли спектрофотометрически при длине волны 600 нм, измеряя кинетику восстановления 2,6-дихлорфенолиндофенола в присутствии феназинметасульфата при ферментативном окислении сукцината натрия (Кривченкова, 1977).

Хемилюминесценцию (ХЛ) липопротеинов сыворотки крови человека или гомогената мозга животных, индуцированную ионами двухвалентного железа (Vladimirov, 1996;

Федорова и соавт., 1999) измеряли с помощью хемилюминометра 1251, LKB (Швеция). В работе анализировали: быструю вспышку ХЛ (h, mV), интенсивность которой характеризует уровень липидных гидроперекисей; лаг-период возгорания ХЛ (, с), длительность которого определяет соотношение про- и антиоксидантов в изучаемой пробе; максимальную величину ХЛ (Н, mV), характеризующую окисляемость образцов; скорость окисления (тангенс угла наклона кривой, V, отн. ед.).

Дыхательный взрыв лейкоцитов крови человека, выделенных по стандартному протоколу, характеризовали хемилюминесцентным методом (хемилюминометр 1251, LKB, Швеция). После добавления в пробу люминола и опсонизированного зимозана измеряли скорость нарастания ХЛ, время достижения максимума ХЛ и его величину, а также светосумму ХЛ за 10 мин период).

Кислотный гемолиз эритроцитов крови человека вызывали внесением в среду, содержащую цельную кровь, 0,1N соляной кислоты и регистрировали изменения оптической плотности на спектрофотометре Ultraspec 3300 фирмы «Amersham» (США) при 660 нм, рассчитывая латентный период и скорость гемолиза (Бохан, Прокопьева, 2004).

Исследование физико-химических характеристик мембран лейкоцитов человека с помощью флуоресцентного зонда пирена. Для измерения флуоресценции суспензию лейкоцитов титровали спиртовым раствором пирена, используя для возбуждения свет с длиной волны 335 нм и регистрируя спектр флуоресценции в области от 360 до 500 нм.

Измерения проводили на термостатированном регистрирующем спектрофлуориметре «ФЛЮОРАТ-02-ПАНОРАМА», производства фирмы «Люмекс», Россия.

Определение гомоцистеина в плазме крови крыс и человека проводили с применением иммунофлуоресцентного метода с помощью набора реактивов фирмы AxisTM (Axis-Shield, Великобритания). Принцип метода заключается в восстановлении всех форм ГЦ, содержащихся в плазме крови, до свободного ГЦ и затем в ферментативном переводе его в S-аденозил-L-гомоцистеин (SAH).

основана на конкуренции SAH из образца и неподвижного SAH на стенках плашки за места связывания на моноклональном анти-SAH антителе. После удаления несвязанных анти-SAH антител добавляются вторичные кроличьи анти-мышиные антитела, помеченные перокисдазой хрена. Пероксидазная активность измеряется спектрофотометрически после добавления субстрата, и поглощение имеет обратную зависимость от концентрации гомоцистеина в образце.

Содержание белка определяли в пробах по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Определение концентрации гемоглобина в крови человека проводили гемоглобинцианидным методом.

Математическая обработка данных проводилась с использованием программы «Statistica 6.0». Все данные представлены в виде M±SEM. Для оценки достоверности обнаруженных изменений применяли тест Стьюдента (при соблюдении условий равенства дисперсий для сравнения средних значений непрерывных признаков в группах), критерий Манна-Уитни (сопоставление двух независимых групп данных по количественным признакам в случае распределений, отличных от нормальных), метод Уилкоксона (сравнение параметров, измеренных до и после лечения). Достоверным считалось такое различие средних показателей, при котором уровень значимости р удовлетворял условию р0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Влияние карнозина на устойчивость клеточных структур крови человека в (липопротеины, химических агентов, мы оценили в опытах in vitro.

1.1. Оценка действия карнозина в условиях Fe2+ -индуцированной хемилюминесценции Для оценки антиоксидантного действия карнозина измеряли устойчивость липопротеинов, выделенных из крови здоровых доноров, к Fe2+-индуцированному окислению.

Таблица 1. Влияние карнозина на параметры Fe2+-индуцированной хемилюминесценции липопротеинов, выделенных из крови здоровых доноров (результаты представлены в процентах по отношению к контролю) Концентрация Полученные результаты представлены в Таблице 1, из которой видно, что в присутствии карнозина наблюдается уменьшение уровня предобразованных гидроперекисей (h), удлинняется лаг-фаза индукции окисления () и снижается скорость окисления, причем эти эффекты имеют дозо-зависимый характер. Таким образом, карнозин способен защищать липопротеины крови от окисления, что может явиться отражением его антиоксидантной активности.

1.2. Влияние карнозина и гомоцистеина на «дыхательный взрыв» лейкоцитов человека, индуцированный опсонизированным зимозаном in vitro На рис. 1 представлено развитие «дыхательного взрыва», индуцированного опсонизированным зимозаном в лейкоцитах, выделенных из крови здорового донора. Видно, что спустя 30-60 с после начала реакции ХЛ сигнал начинает расти, что свидетельствует об образовании активных форм кислорода. Это является следсьтвием известного эффекта зимозана, направленного на активацию НАДФН-оксидазного комплекса, что ведет к образованию супероксид-аниона.

Рис. 1. Развитие «дыхательного взрыва» в суспензии лейкоцитов здорового донора. На 2 мин измерений в пробу был добавлен люминол (Л), на 4 мин – зимозан (З).

В этих условиях 15-мин преинкубация лейкоцитов с ГЦК приводит к уменьшению скорости нарастания хемилюминесценции (на 95-98%) и светосуммы сигнала (на 86-88%) (Рис. 2А). Карнозин в тех же условиях оказывал аналогиченое действие (Рис. 2Б).

Совместное действие этих агентов дает аналогичную картину (Рис. 2В).

Рис. 2. Влияние карнозина (А), ГЦК (Б) и ГЦК на фоне карнозина (В) на параметры дыхательного взрыва описанным в литературе нарушением мембранного циттоскелетка, что, безуслвно, должно отразиться на эффективности сборки НАДФН-оксидазного комплекса. Внешне аналогичное действие карнозина, однако, может имиеть совершенно отличную природу, основанную на его хорошо известной способности тушить свободные радикалы (Курелла и соавт., 1992) и модулировать процесс дыхательного взрыва (Стволинский и соавт., 1993). Следовательно, обнаруженное нами дейстувие ГЦК, также может отражать ее иммуномодулирующую активность.

Измерения процесса кислотного гемолиза проводили при постоянном значении pH в пробе. В этих условиях скорость гемолиза, вызванного 0,1N HCl, составляла 0,2 усл.ед./мин, а латентный период составлял величину порядка 150 с. Преинкубация эритроцитов человека с 250 мкМ ГЦК в течение 30 мин вызывала укорочение латентного периода гемолиза на 67и увеличение его скорости на 145%. В противоположность этому, совместная инкубация клеток с карнозином (250 мкМ) и ГЦК (250 мкМ) приводила к снижению скорости гемолиза (на 25-50%) без изменения латентного периода. Полученные данные указывают, что карнозин способен защитить мембраны эритроцитов крови человека от повреждения, вызванного действием ГЦК. Данные результаты позволяют предполагать, что ГЦК в используемой модели оказывает на мембраны дезинтегрирующее действие, а карнозин, напротив, проявляет мембраностабилизирующий эффект.

Таким образом, помимо прямого антиоксидантного действия на липопротеины и иммуномодулирующего действия на лейкоциты, мы описали мембраностабилизирующее действие карнозина, направленное на защиту эритроцитов от кислотного гемолиза.

1.4. Эксимеризация пирена в суспензии лейкоцитов донорской крови Регистрация спектров флуоресценции в мембранах лейкоцитов показала, что свидетельствует о возрастании жидкостности мембранного бислоя (Boldyrev et al. 1983) и соответствует известным данным о нарушении упаковки клеточных мембран гомоцистеином и его производными (Baydos et al., 2008). В данных условиях карнозин вновь демонстрирует защитное действие от дезинтегрирующего эффекта ГЦК, восстанавливая присущий интактным мембранам низкий уровень эксимеризации пирена (Рис. 3). Таким образом, карнозин выступает в качестве мембраностабилизирующего агента.

Рис. 3. Влияние ГЦК и карнозина на соотношение величины пиков Fэ(474 нм)/Fм(393 нм) в суспензии лейкоцитов человека (* - достоверно по отношению к контролю, #- достоверное отличие по отношению к контроль+ГЦК 250 мкМ) Демонстрация мембранопротекторных свойств карнозина на моделях in vitro поднимает вопрос о возможности аналогичных эффектов в условиях целого организма.

Глава 2. Действие карнозина на крыс Вистар в условиях гипобарической гипоксии, патологических факторов – гипоксии и введение 3-НПК, вызывающей ингибирование заболеваний (Степанова и соавт., 2005). В этих условиях мы провели оценку защитного действия карнозина при его курсовом введении.

Введение 3-НПК начиная с 3 дня после гипоксического эпизода вызывает у животных отчетливое нарастание неврологической симптоматики (2,7 балла к 7 дню эксперимента), в то время как у гипоксических животных, не получавших 3-НПК, неврологическая симптоматика не выявлялась. В то же время, у крыс, получавших карнозин в постгипоксическом периоде, отягощенном введением 3-НПК, выявлялось достоверное