Изучение взаимосвязи полиморфизма систем групп крови и n-ацетилирования с риском развития рака прямой кишки и с целью индивидуализации терапии

На правах рукописи

Маркарова Екатерина Васильевна

Изучение взаимосвязи полиморфизма систем групп

крови и N-ацетилирования с риском развития рака

прямой кишки и с целью индивидуализации

терапии

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ

на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2007 2

Работа выполнена в Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук Голденкова-Павлова Ирина Васильевна доктор биологических наук Радкевич Людмила Александровна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Засухина Галина Дмитриевна доктор медицинских наук, профессор Комиссарова Ирина Алексеевна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биохимии и генетики Уральского научного центра Российской академии наук.

Защита состоится "19" апреля 2007 года в 11.00 на заседании диссертационного совета Д002.252.01 при Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН по адресу: 119991 ГСП-1, Москва, ул. Ленинский проспект 38, к.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Автореферат разослан ““ марта 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 002.252. Доктор биологических наук Радкевич Л.А.

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертационной работы. Частота заболеваемости той или иной патологией в разных популяциях различна, и это отличие связано не только с различными экологическими и социальными условиями, но также обусловлено генетическими различиями, приводящими к вариабельности в метаболических параметрах (Пирузян Л.А., 2004, Пирузян Л.А. и соавт., 2004; Пирузян А.Л., 2005). Такие метаболические отличия зачастую могут быть обусловлены однонуклеотидными заменами (SNP) в колирующих последовательностях генов, что приводит к модуляции функционирования белкового продукта: увеличению, снижению или полному отсутствию активности белка. Определение значения отдельных генов, их полиморфизмов и вариаций в проявлении индивидуальных фенотипов человека позволит приблизиться к пониманию биологической сущности заболеваний, а получаемые при таком подходе данные дадут возможность выделять группы риска развития исследуемой патологии.

Заболевание может развиваться в случае неблагоприятного сочетания полиморфных генов, вклад которых в развитие патологического процесса будет различным (Алтухов Ю.П., Курбатова О.Л., 1984; Жукова О.В. с соавт., 2005). При этом следует принимать во внимание и индивидуальный полиморфизм генов, продукты которых могут и не иметь прямого отношения к данной патологии. А именно, индивидуальные генетические особенности организма, определяющие кинетику метаболических превращений лекарственных препаратов, канцерогенов окружающей среды, индустриальных и пищевых источников.

Рак прямой кишки по распространенности и причине смертности населения занимает одно из первых мест среди злокачественных опухолей во многих экономически развитых странах. Заболеваемость этой формой рака стоит на втором месте после рака легких у мужчин и рака молочной железы у женщин, а по уровню смертности эта патология находится после рака легких, опережая опухоли желудка, предстательной железы и все другие локализации.

Колоректальный рак в структуре онкологической заболеваемости составляет в странах Европы и Америки от 9 до 14%. Ежегодно в мире регистрируется около 800 000 больных раком этой локализации и 440 000 смертей от этого заболевания. Рост заболеваемости наблюдается и в России: в 1980 году злокачественные образования этой локализации были диагностированы у 16 человек на 100 000 населения, а в 2000 году этот показатель приблизился к 25. Проблема ранней диагностики опухолевого процесса одна из насущных в современной онкологии. Рост заболеваемости и смертности, скудная симптоматика на ранней стадии заболевания, сходство ее с различными заболеваниями толстой кишки, поздняя обращаемость пациентов за квалифицированной медицинской помощью являются определяющими факторами того, что 30пациентов в последующем подвергаются радикальному лечению.

В связи с этим, актуальными являются исследования, посвященные поиску и идентификации генетических факторов риска этой патологии с целью разработки новых скрининговых программ профилактики и донозологической диагностики, а также индивидуального подбора лекарственных препаратов в клинике. Следует подчеркнуть, что для определения фенотипспецифичных генов заболевания, необходимо применять генетический анализ к различным клиническим группам больных, при этом клинический фенотип каждого пациента должен быть охарактеризован досконально. В связи с этим, разработка новых подходов в донозологической диагностики на основе анализа клинических, биохимических и генетических характеристик больных является важной медико-генетической задачей.

Цель исследования: разработать подходы донозологической диагностики рака прямой кишки на основе сравнительного анализа клинических, биохимических и генетических характеристик здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки с целью индивидуализации фармакотерапии и профилактики. Определены следующие задачи исследования:

- Провести сбор информационного и клинического материала у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки;

- Создать компьютерный регистр больных раком прямой кишки на основании информационного материала ИИК (индивидуальная информационная карта);

- Определить особенности распространения классических генетических маркеров (AB0, Rhesus, MN, Kell) у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки;

- Провести сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования в московской выборке волонтеров;

- Провести анализ ассоциации полиморфных вариантов гена NAT2 (N-ацетилтрансферазы 2) с риском развития рака прямой кишки;

- Изучить особенности клинических проявлений у пациентов с различным генетическим полиморфизмом системы групп крови и ацетилирования.

- Разработать и предложить новый подход для донозологической диагностики, индивидуальной профилактики, а также оптимизации терапии рака прямой кишки, основанный на анализе метаболического и генетического статуса индивидуумов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Показано, что разработанные и апробированные нами критерии Индивидуальной информационной карты (ИИК), позволяют получать необходимую информацию для индивидуального описания пациента с раком прямой кишки. Впервые показано, что при определении риска развития рака прямой кишки следует использовать совокупность генетических маркеров, основанных на полиморфизме систем групп крови и ацетилирования. Продемонстрированы возможности подхода, основанного на интеграции клинических обследований и результатов молекулярно-генетических исследований, выявлять группы риска развития онкологической патологии ректального отдела кишечника.

Установленное разнообразие среди пациентов с раком прямой кишки по генотипу и фенотипу NAT2 с доминированием медленного N-ацетилирования (NAT2*5/*5) позволит индивидуализировать и оптимизировать фармакологическую и лучевую терапию с учетом известной более высокой чувствительности медленных N-ацетиляторов к побочному действию лекарств и канцерогенов.

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на III Съезде Биофизиков России, (Воронеж, 2004 г.); III съезде ВОГиС “Генетика в ХХI веке: современное состояние и перспективы развития” (Москва, Россия, 2004); XI и XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004); на заседании научного семинара Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН и на семинарах лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на _ страницах машинописного текста, включая 7 таблиц и 25 рисунков. Список цитируемых литературных источников включает наименование.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ПО ГЛАВАМ

ГЛАВА 1. Обзор литературы. Приводятся литературные данные о структуре генома человека и его полиморфизме. В первом разделе приводится описание основных видов генетического полиморфизма и их значимость для медицины. Описывается генетический полиморфизм системы групп крови и корреляция фенотипов групп крови с заболеваемостью и смертностью.

Здесь же описывается генетический полиморфизм системы N-ацетилирования у человека, рассматриваются методы определения фенотипа и генотипа N-ацетилирования, представляются литературные данные о связи генетического полиморфизма в системе N-ацетилирования с развитием ряда патологий, в том числе и онкологических. Во втором разделе суммированы данные о раке прямой кишки, кратко освещены вопросы эпидемиологии, приводятся современные классификации заболевания, описаны методы диагностики и лечения, кратко рассмотрены основные этиологические факторы.

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.

Популяционные выборки Москвы Исследования больных раком прямой кишки проводили в ГКБ №24 (под руководством доктора медицинских наук, профессора В.Б.

Александрова). Обследованная выборка включала 104 пациента с раком прямой кишки. Сбор информационного материала проводили с использованием Индивидуальной Информационной Карты (ИИК), которая включает более 40 критериев. Клинический материал был получен также от волонтеров, которые проживают в г. Москва. В эксперименты: по определению фенотипа ацетилирования были включены 131 человек, по определению генотипа ацетилирования – человек, для выявления взаимосвязи между фенотипом и генотопом ацетилирования – человек. Генотипирование клинического материала. Определение антигенной специфичности групп крови систем AB0, Rhesus, Kell-Chellano, MNNs проводили стандартными серологическими методами агглютинации эритроцитов на плоскости и в пробирках [Иммуносерология (нормативные документы), 1998]. Для оценки достоверности различий по частотам фенотипов между двумя группами обследованных использовали стандартные статистические методы [Плохинский, 1970]. Определение фенотипа ацетилирования проводили по методу Bratton & Marshall (1938) в нашей модификации. Фенотип Nацетилирования определяется как скорость ацетилирования сульфадимезина и рассчитывается как соотношение АЦС к ОБС (в %). Выделение геномной ДНК проводили из лимфоцитов крови согласно [Sambrook, Russell, 2001]. Генотип NAT2 был охарактеризован с помощью результатов гибридизации на биочипе [Глотов с соавт., 2005].

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Анализ клинических данных пациентов с раком прямой кишки.

Первоначально, Индивидуальная Информационная Карта (ИИК), разработанная ранее [Пирузян А.Л., 2005], и модифицированная нами, была использована для сбора информационного материала о пациентах с раком прямой кишки. На основе данных ИИК был создан компьютерный регистр данных о пациентах с раком прямой кишки, в эксперимент были включены 104 пациента. Анализ базы данных о пациентах с раком прямой кишки позволил продемонстрировать возможности предложенных критериев для выявления как индивидуальных, так и общих особенностей больных этой патологией, а также для классификации пациентов по сходным показателям. В таблице 1 представлены данные клинических характеристик пациентов с раком прямой кишки.

Как видно из представленных результатов, большинство пациентов с раком прямой кишки, которые были включены в исследование, составляют индивидуумы в возрасте старше 50 лет высокодифференцированная аденокарцинома. При этом отмечено, что у мужчин несколько выше процент больных с высокодифференцированной аденокарциномой, и несколько ниже – со среднедифференцированной аденокарциномой. Сопутствующие патологии отмечены у более 90% пациентов с раком прямой кишки. Возможно, высокий процент пациентов с сопутствующими заболеваниями связан с тем, что большинство пациентов составляют индивидуумы старше 50 лет. Относительно высокий процент пациентов (более 30%) имеет в анамнезе патологические изменения, такие как кисты, опухоли, полипы и гиперплазии, и эти пациенты могут быть отнесены к группе риска развития рака прямой кишки. Клиницистам следует обращать внимание на таких индивидуумов до постановки диагноза рак прямой кишки и рекомендовать им сдачу пробы на скрытую кровь и пальцевое исследование ежегодно, а также раз в 3 года - фиброколоноскопию или ирригоскопию.

Таблица 1. Клинические характеристики пациентов с раком прямой кишки.

Возраст:

Гистологическая форма Патологические изменения гиперплазии) Наследование Чувствительность к Примечание: все данные представлены в процентах. ВДА, СДА, НДА – высоко-, средне и низкодифференцированная аденокарценома, прочие - инвазивный плоскоклеточный, перстневидноклеточный и плоскоклеточный неороговевший.

Для выяснения вопроса о роли наследования в развитии рака прямой кишки был проведен анализ базы данных о пациентах (табл. 1.). Как видно из представленных данных, только 20% пациентов ответили утвердительно о наличии или отсутствия наследственности онкологическими заболеваниями среди родственников первой и второй степени родства. При этом только приблизительно у 10% пациентов есть родственники, имеющие онкологические заболевания в анамнезе. Низкий процент наследуемости рака прямой кишки (10%), выявленный при анализе базы данных, по-видимому, не отражает общей картины наследования патологии, что связано с тем, что большинство пациентов (80%) не имеют сведений о своих родственниках.

Известно, что большинство экзогенных и эндогенных соединений, включая лекарственные препараты и токсические вещества, попадая в организм, подвергаются биотрансформации.

Индивидуальный ответ на ксенобиотики, включая лекарственные препараты, является генетически детерминированным, и генетические полиморфизмы в генах системы биотранссформации могут изменить риск развития ряда патологий, связанных с воздействием канцерогенного вещества. Анализ базы данных о пациентах позволил выявить более 10% индивидуумов, у которых отмечена лекарственная чувствительность.

На основании изложенного выше можно заключить следующее: критерии для индивидуального описания пациента с раком прямой кишки, разработанные и апробированные нами, обеспечивают необходимой информацией о патологическом процессе, позволяют получать унифицированные данные, которые можно легко формализовать, и создавать на их основе стандартизированные (унифицированные) базы данных о патологии. Следует особо подчеркнуть, что, по нашему мнению, использование совокупности унифицированных критериев для описания пациента позволит проводить сравнительный анализ экспериментальных данных, получаемых различными исследователями, как в области изучения патогенеза и генетики патологии, так и в области индивидуального ответа пациента на применение лекарственных препаратов.

3.2. Сравнительное изучение полиморфизма систем групп крови у пациентов с раком прямой кишки и здоровых индивидуумов московской выборки.

Цель данного раздела работы – выяснить имеются ли различия в особенностях распространения классических генетических маркеров у практически здорового населения и пациентов с раком прямой кишки в московской выборке. Для этой цели, клинический материал пациентов с раком прямой кишки (104 пациента) был проанализирован с использованием стандартных методов реакции агглютинации. Результаты генотипирования здоровых индивидуумов (700 человек) были любезно предоставлены к.б.н. О.Л. Курбатовой (Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН). Выбор генетических маркеров систем групп крови, основан на данных, имеющихся в литературе о корреляции полиморфизма системы групп крови с заболеваемостью, заживлений ран и смертностью от заболеваний (Алтухов Ю.П., Курбатова О.Л., 1984; Жукова О.В. с соавт., 2005).

На основании результатов типирования полиморфизма системы групп крови были рассчитаны частоты фенотипов по каждой из изученных систем наследственного полиморфизма в двух группах индивидуумов – больных раком прямой кишки и «здоровых» с использованием теста 2 (данные в автореферате не приводятся). В группе пациентов с раком прямой кишки частота гена В достоверно выше по сравнению с контрольной группой. В контрольной группе соотношение числа лиц с группами крови А и В составляет примерно 2:1, а в группе пациентов это соотношение - примерно 1:1. Следует также отметить, что наблюдается тенденция к снижению доли лиц с фенотипом АВ в группе пациентов, по сравнению с контрольной группой.

Распределение фенотипических комбинаций, рассмотренных как система генотипов трех тесно сцепленных локусов (локус Dd, Cc и Ee), в сравниваемых группах достоверно не отличается.

Распределение генотипов двух тесно сцепленных локусов в сравниваемых группах достоверно